Gardner estaba visitando a su hermana Beatrice en la ciudad de Nueva York en el verano de 1940, cuando el marido de Beatrice, Larry Tarr, fotógrafo profesional, se ofreció a hacerle un retrato como regalo para su madre Molly. Estaba tan satisfecho con el resultado que expuso el producto terminado en el escaparate de su estudio fotográfico Tarr en la Quinta Avenida.
Un empleado jurídico de Loews Theatres, Barnard Duhan, vio el retrato de Gardner en el estudio de Tarr. En aquella época, Duhan solía hacerse pasar por un cazatalentos de la Metro-Goldwyn-Mayer (MGM) para conocer chicas, aprovechando que la MGM era una filial de Loews. Duhan entró en el estudio de Tarr e intentó conseguir el número de Gardner, pero fue rechazado por la recepcionista. Duhan comentó: «Alguien debería enviar su información a MGM», y los Tarr lo hicieron inmediatamente. Poco después, Gardner, que en ese momento era estudiante del Atlantic Christian College, viajó a Nueva York para ser entrevistada en la oficina de MGM en Nueva York por Al Altman, jefe del departamento de talentos de MGM en Nueva York. Con las cámaras rodando, le indicó a la joven de 18 años que caminara hacia la cámara, se diera la vuelta y se alejara, y luego reacomodara unas flores en un jarrón. No intentó grabar su voz porque su fuerte acento sureño le dificultaba entenderla. Sin embargo, Louis B. Mayer, jefe de la MGM, envió un telegrama a Altman: «No sabe cantar, no sabe actuar, no sabe hablar, ¡es estupenda!». El estudio le ofreció un contrato estándar y dejó la escuela para ir a Hollywood en 1941, con su hermana Beatrice acompañándola. Lo primero que hizo la MGM fue proporcionarle un profesor de oratoria, ya que su acento de Carolina era casi incomprensible para ellos, y a Harriet Lee como profesora de canto.
Su primera aparición en un largometraje fue como actriz de reparto en el vehículo de Norma Shearer We Were Dancing (1942). Quince papeles secundarios más tarde, recibió su primera actuación en la pantalla en 3 hombres de blanco (1944), una película del Dr. Kildare en la que lleva a su madre al hospital para recibir tratamiento. Tras cinco años de papeles secundarios, la mayoría en la MGM y muchos de ellos sin acreditar, Gardner alcanzó la fama en la producción de Mark Hellinger Los asesinos (1946), interpretando a la femme fatale Kitty Collins.
Otras películas notables son The Hucksters (1947), Show Boat (1951), The Snows of Kilimanjaro (1952), Lone Star (1952), Mogambo (1953), The Barefoot Contessa (1954), Bhowani Junction (1956), The Sun Also Rises (1957) y On the Beach (1959). Fuera de las cámaras, podía ser ingeniosa y concisa, como en su valoración del director John Ford, que dirigió Mogambo («El hombre más malo de la tierra.) En La condesa descalza, interpretó el papel de la condenada belleza María Vargas, una mujer ferozmente independiente que pasa de bailarina española a estrella de cine internacional con la ayuda de un director de Hollywood interpretado por Humphrey Bogart, con trágicas consecuencias. La decisión de Gardner de aceptar el papel estuvo influida por su propia costumbre de toda la vida de ir descalza. A continuación, Gardner interpretó el papel de Ginebra en Caballeros de la Mesa Redonda (1953), frente al actor Robert Taylor como Sir Lancelot. Como muestra de su sofisticación, interpretó a una duquesa, una baronesa y otras damas de noble linaje en sus películas de la década de 1950.
En 1960, interpretó el papel de Soledad en El ángel vestía de rojo. En 1963, fue contratada entre Charlton Heston y David Niven para 55 Days at Peking (1963), ambientada en China durante la rebelión de los bóxers en 1900. Al año siguiente, interpretó su último gran papel protagonista en la aclamada La noche de la iguana (1964), basada en una obra de Tennessee Williams y protagonizada por Richard Burton en el papel de un clérigo ateo y Deborah Kerr como una gentil artista que viaja con su anciano abuelo poeta. John Huston dirigió la película en Puerto Vallarta, México, e insistió en hacerla en blanco y negro, una decisión de la que luego se arrepintió por los vivos colores de la flora. Gardner fue nombrada por debajo de Burton, pero por encima de Kerr. Fue nominada al Globo de Oro a la mejor actriz de cine – drama y al premio BAFTA a la mejor actriz protagonista por su interpretación.
La siguiente vez que apareció fue con Burt Lancaster, su compañero de reparto en Los asesinos, esta vez junto a Kirk Douglas y Fredric March, en Siete días de mayo (1964), un thriller sobre un intento de toma de posesión militar del gobierno estadounidense. Gardner interpretó a un antiguo interés amoroso de Lancaster que podría haber sido decisivo para que Douglas impidiera un golpe de estado contra el presidente de los Estados Unidos.
John Huston eligió a Gardner para el papel de Sara, la esposa de Abraham (interpretada por George C. Scott), en la película de Dino De Laurentiis La Biblia: En el principio…, que se estrenó en 1966. En una entrevista de 1964, habló de por qué aceptó el papel:
Él tenía más fe en mí que yo misma. Ahora me alegro de haberle hecho caso, porque es un papel desafiante y muy exigente. Comienzo como una esposa joven, y envejezco a través de varios períodos, lo que me obliga a ajustarme psicológicamente a cada edad. Es un cambio completo para mí, y muy intrigante. En este papel, debo crear un personaje, no sólo interpretarlo.
Dos años después, en 1966, Gardner buscó brevemente el papel de la señora Robinson en El graduado (1967), de Mike Nichols. Al parecer, llamó a Nichols y le dijo: «¡Quiero verte! Quiero hablar de lo de El graduado». Nichols nunca la consideró seriamente para el papel, ya que prefería contratar a una mujer más joven (Anne Bancroft tenía 35 años, mientras que Gardner tenía 44), pero sí visitó su hotel, donde, según contó más tarde, «se sentó en un pequeño escritorio francés con un teléfono, y repasó todos los clichés de las estrellas de cine. Me dijo: ‘Muy bien, hablemos de tu película. En primer lugar, no me desnudo para nadie».
Gardner se trasladó a Londres en 1968, y se sometió a una histerectomía electiva para disipar sus temores de contraer el cáncer de útero que se había cobrado la vida de su madre. Ese año, apareció en Mayerling, en la que interpretó el papel secundario de la emperatriz austriaca Isabel de Austria, frente a James Mason como el emperador Francisco José I.
Apareció en varias películas de catástrofes a lo largo de la década de 1970, especialmente en Terremoto (1974) con Heston, El cruce de Cassandra (1976) con Lancaster, y la película canadiense Ciudad en llamas (1979). Apareció brevemente como Lillie Langtry al final de The Life and Times of Judge Roy Bean (1972), y en The Blue Bird (1976). Su última película fue Regina Roma (1982). En la década de 1980, actuó principalmente en televisión, incluyendo el remake de la miniserie The Long, Hot Summer y en un arco argumental en Knots Landing (ambos en 1985).