La profase tardía, o prometafase, comienza con la disrupción de la envoltura nuclear, que se descompone en pequeñas vesículas de membrana que se asemejan mucho al retículo endoplásmico y tienden a permanecer visibles alrededor del huso mitótico. Durante este periodo, los cromosomas continúan condensándose y se acortan y engrosan gradualmente hasta que han formado completamente las unidades que sufrirán la mitosis. El nucléolo, que aún puede estar presente en algunas células, también desaparece por completo en la prometafase.

En la imagen de microscopía de fluorescencia digital de arriba se muestra una única célula de riñón de canguro de rata (PtK2) en las primeras etapas de la prometafase. La cromatina se tiñe con una sonda fluorescente azul (DAPI), mientras que la red de microtúbulos (huso mitótico) se tiñe de verde (Alexa Fluor 488) y las mitocondrias celulares se tiñen con un colorante rojo (MitoTracker Red CMXRos). Durante la prometafase, los microtúbulos del huso mitótico están ahora libres para entrar en la región nuclear, y comienza la formación de complejos proteicos especializados conocidos como cinetocoros en cada centrómero. Estos complejos se unen a un subconjunto de microtúbulos del huso, que se denominan entonces microtúbulos del cinetocoro. Otros microtúbulos del huso (no unidos a los centrómeros) se denominan microtúbulos polares, y ayudan a formar y mantener la estructura del huso junto con los microtúbulos astrales, que permanecen fuera del huso.

El límite entre la profase y la prometafase está determinado por el rápido inicio de la fosforilación en toda la lámina nuclear desencadenada por la activación de una enzima denominada proteína quinasa inductora de mitosis (abreviada MPF). Como resultado, el complejo de la membrana nuclear se desagrega en vesículas, exponiendo los cromosomas condensados a la red microtubular en expansión del huso mitótico. En el microscopio óptico, las vesículas de la membrana nuclear, que son prácticamente indistinguibles de porciones desagregadas similares del retículo endoplásmico, pueden visualizarse en la región que rodea al huso en crecimiento.

A medida que los microtúbulos del cinetocoro se unen a sus receptores en los cinetocoros de las cromátidas, los cromosomas entran en movimiento agitado y se mueven rápidamente hacia adelante y hacia atrás a medida que el huso ejerce tensión. Simultáneamente, los microtúbulos polares que emanan de los centrosomas interactúan entre sí para formar una red de interconexión entre los cromosomas y establecer aún más la estructura del huso mitótico. Los cinetocoros se ensamblan en el centrómero de cada cromátida para dar lugar a dos cinetocoros por cromosoma. Finalmente, en la anafase, los microtúbulos de los cinetocoros tirarán de las cromátidas hermanas hacia polos opuestos del huso mitótico para asegurar que cada célula hija reciba un complemento genético completo de cromosomas.

La complejidad de la relación entre los cinetocoros y el huso mitótico refleja el requisito de una distribución precisa del material genético entre las células en división. El error más común en la mitosis es la falta de separación entre las cromátidas hermanas, lo que hace que una de las dos células hijas reciba las dos copias de los cromosomas. Este error, que se produce aproximadamente una vez cada 100.000 divisiones celulares, puede tener lugar si las cromátidas no se adhieren al polo correcto del huso o si un par de cromátidas se adhiere sólo a un polo. En algunos casos, las dos cromátidas hermanas, aunque se ensamblan correctamente en el aparato del huso mitótico, simplemente no se separan en la anafase.