Tipificación del ADN: Minisatélites y Repeticiones Cortas en Tándem
La tipificación del ADN proporciona ventajas evidentes sobre el análisis tradicional de proteínas, principalmente porque es más informativo y puede ser analizado en material diminuto o degradado ya que el ADN es físicamente mucho más resistente a la degradación que las proteínas. Además, se puede obtener el mismo genotipo de ADN de cualquier tejido (es decir sangre, saliva, semen, pelo, piel y huesos), mientras que el análisis de los marcadores proteicos está restringido a las células donde se expresan estas proteínas.
Los minisatélites se detectaron inicialmente mediante la hibridación de sondas en Southern blots de ADN genómico digerido por enzimas de restricción, y las «secuencias centrales» compartidas entre diferentes loci de minisatélites permitieron aplicar sondas para detectar muchos minisatélites independientes simultáneamente, dando lugar a los patrones multibanda hipervariables conocidos como huellas de ADN.
Originalmente, se propusieron sondas multilocus para el análisis genético forense. Sin embargo, este tipo de sondas no tuvieron mucho éxito en el ámbito forense, ya que aunque eran muy informativas, surgían problemas estadísticos de evaluación de las pruebas en casos de coincidencia de bandas y de estandarización. Por estas razones, las sondas multilocus se sustituyeron en el ámbito forense por el uso de minisatélites específicos clonados, «sondas de locus único» (SLP), en las que cada una revelaba un único polimorfismo de longitud de fragmento de restricción altamente polimórfico, lo que simplificaba la interpretación. Normalmente, se utilizaban cuatro SLP sucesivamente para sondear un Southern blot, con lo que se obtenían ocho fragmentos hipervariables por individuo.
Fue con SLP que se llevó a cabo la primera investigación criminal basada en el ADN; este caso culminó con la condena de Colin Pitchfork por una doble violación y homicidio en Leicestershire en 1986. Muy pronto, el análisis de ADN se convirtió en el método estándar de la genética forense, ya que fue utilizado por la mayoría de los laboratorios en toda la gama de aplicaciones, especialmente en el trabajo forense criminal (análisis de manchas y pelos) y en la identificación.
Hasta la introducción del análisis de repeticiones cortas en tándem (STR) por amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el análisis de minisatélites con SLP era muy popular en los laboratorios forenses.
La principal ventaja del análisis de SLP es la enorme variabilidad de algunos de los loci de minisatélites y el conocimiento bien documentado de la tasa de mutación en algunos de ellos. Las principales desventajas son el tiempo necesario para el análisis y la necesidad de contar con cantidades relativamente grandes de ADN no degradado, necesarias para el éxito de la tipificación del SLP. Dado que el ADN extraído de los especímenes forenses suele estar degradado debido a las condiciones ambientales, las técnicas de SLP a menudo no han producido resultados fiables. La PCR ha superado estas dificultades y ha potenciado enormemente la utilidad de las técnicas de elaboración de perfiles de ADN en la ciencia forense.
El método de la PCR fue ideado y bautizado por Mullis y sus colegas de la Cetus Corporation en 1987, aunque el principio había sido descrito en detalle por Khorana et al. más de una década antes; sin embargo, el uso de la PCR fue limitado hasta que se dispuso de polimerasas de ADN termoestables adecuadas de bacterias termófilas.
La mayoría de los sistemas de tipificación de ADN basados en la PCR permiten identificar los alelos como entidades discretas, facilitando así la estandarización al evitar la mayoría de los problemas estadísticos que surgen al emparejar y agrupar bandas de SLP que ocupan un continuo. Además, aparte de la mayor sensibilidad inherente a cualquier técnica de PCR, es más probable que tenga éxito en el análisis de material antiguo o muy degradado, principalmente debido al menor tamaño de muchos de los polimorfismos de ADN (SNPs y STRs), lo que los hace más susceptibles de ser analizados por PCR.
El primer grupo de marcadores utilizados tras la amplificación por PCR fueron los genes HLA de clase II, especialmente el sistema HLA DQA1 analizado con el uso de sondas de oligonucleótidos de secuencia específica. Casi inmediatamente después de que se demostrara que era factible analizar los marcadores de ADN mediante la tecnología PCR, se pusieron a la venta kits para varios loci genéticos. El kit de amplificación de PCR AmpliType PolyMarker (Perkin-Elmer, Foster City, CA, EE.UU.) era muy popular en los laboratorios forenses en aquella época. Con este kit, los loci HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC se amplifican de forma múltiple. Los últimos cinco loci enumerados se tipificaron simultáneamente en una única tira de dot-blot inversa que contenía sondas ASO; el HLA DQA1 se tipificó en una tira separada.
Los esfuerzos de los científicos forenses se dirigieron entonces a la amplificación de polimorfismos de longitud de fragmento. El minisatélite D1S80 (pMCT118) fue el primero que se aplicó al análisis forense, pero todos estos primeros sistemas de PCR fueron sustituidos por los STR (denominados alternativamente microsatélites). El análisis de los STRs por PCR es ahora el método de elección para la identificación forense basada en el ADN.
Los STRs se descubrieron en 1989 y se aplicaron a los casos forenses a principios de la década de 1990. Las ventajas de utilizar STRs de repetición de tetra y pentanucleótidos (unidades de repetición de 4 y 5 bases) sobre los di y trinucleótidos (repeticiones de 2 y 3 bases) pronto se hicieron evidentes y se inició una búsqueda sistemática de los STRs más convenientes. A esto le siguió el proceso de estandarización de las técnicas y la nomenclatura llevado a cabo por organismos como el SWGDAM en Estados Unidos y el EDNAP en Europa, además del papel activo de la Comisión de ADN de la ISFG.
Otro paso importante fue la posibilidad de amplificar múltiples loci de STR en una única reacción combinada de PCR múltiple. Cuando este enfoque de la PCR se combinó con la detección directa de los productos amplificados en geles de poliacrilamida, la elaboración de perfiles de ADN de STR se hizo susceptible de automatización. A partir de 1993 se disponía de multiplexores comerciales de STR para sistemas electroforéticos manuales. Los geles de poliacrilamida desnaturalizante se utilizaban para la separación de los fragmentos de ADN hasta la introducción de la electroforesis capilar que, junto con la introducción de la tecnología de cebadores marcados con colorantes fluorescentes y el uso de secuenciadores de ADN, revolucionó el campo, permitiendo la tipificación de grandes multiplex de STR. Desde entonces, existen varios multiplex comerciales marcados con colorantes y todos incluyen una serie de STRs más la amelogenina para la determinación del sexo. Los multiplex utilizados actualmente combinan 15 STRs o más. El poder de discriminación combinado de las RTS es muy elevado y las probabilidades de que dos individuos no relacionados coincidan por casualidad (probabilidad de coincidencia aleatoria – RMP) son inferiores al 10-15 para la mayoría de los multiplexores de RTS más grandes.
Desde mediados de la década de 1990, las bases de datos informáticas que contienen perfiles de RTS de muestras del lugar del delito, de delincuentes condenados y, en algunos casos, de personas detenidas pero posteriormente absueltas de un delito, han proporcionado a los organismos encargados de la aplicación de la ley la capacidad de vincular a los delincuentes con los perfiles de RTS del lugar del delito. La aplicación de esta tecnología ha permitido resolver miles de delitos en todo el mundo.
Por último, el rediseño de los cebadores de la PCR, más próximos a la región de repetición de los STR, permitió en 2001 la creación de «miniSTR» con potencial para mejorar el análisis del material biológico degradado.