RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para clonar el gen de la miostatina de otras especies, se construyeron bibliotecas de ADNc a partir de ARN aislado del tejido muscular esquelético y se examinaron con una sonda de miostatina de ratón correspondiente a la región C-terminal conservada, que es la parte madura y activa de la molécula. En la Fig. 1 se muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos predichas de la miostatina murina, de rata, humana, de babuino, de bovino, de porcino, de ovino, de pollo, de pavo y de pez cebra, deducidas del análisis de la secuencia de nucleótidos de los clones de ADNc de longitud completa. Todas estas secuencias contienen una putativa secuencia de señal para la secreción y un putativo sitio de procesamiento proteolítico RXXR (aminoácidos 263-266) seguido por una región que contiene los residuos de cisteína C-terminal conservados que se encuentran en todos los miembros de la familia del factor de crecimiento transformante β (1). Como se observa en este alineamiento, la miostatina está muy conservada en todas las especies. De hecho, las secuencias de la miostatina murina, de rata, humana, porcina, de pollo y de pavo son 100% idénticas en la región C-terminal que sigue al sitio de procesamiento proteolítico putativo, y la miostatina de babuino, bovino y ovino contienen sólo de uno a tres aminoácidos de diferencia en la proteína madura. La miostatina del pez cebra es considerablemente más divergente y es sólo un 88% idéntica a las demás en esta región.
Alineación de la secuencia de aminoácidos de la miostatina murina, de rata, humana, de babuino, bovina, porcina, ovina, de pollo, de pavo y de pez cebra. Los residuos sombreados indican los aminoácidos que coinciden con el consenso. Los aminoácidos están numerados en relación con la secuencia humana. Las líneas discontinuas indican huecos.
El alto grado de conservación de la secuencia de la miostatina entre las especies sugiere que la función de la miostatina también se ha conservado. Para determinar si la miostatina desempeña un papel en la regulación de la masa muscular en otros animales además de los ratones, investigamos la posibilidad de que las mutaciones en el gen de la miostatina pudieran explicar el aumento de la masa muscular observado en las razas de ganado con doble musculatura. La doble musculatura, que se ha observado en muchas razas de ganado durante los últimos 190 años, parece heredarse como un único locus autosómico principal con varios modificadores de la expresión fenotípica, lo que da lugar a una penetrancia incompleta (7). En la raza bovina de doble musculatura más estudiada, la Azul Belga, el fenotipo de doble musculatura (Fig. 2) se segrega como un único locus genético denominado hipertrofia muscular (mh) (8). La mutación mh, que es parcialmente recesiva, provoca un aumento medio de la masa muscular del 20-25%, una disminución de la masa de la mayoría de los demás órganos (9, 10) y una disminución de la grasa intramuscular y del tejido conjuntivo (11). El locus mh está estrechamente ligado a marcadores en una región del cromosoma 2 bovino (12) que es sintético a una región del cromosoma 2 humano (2q32) (13) a la que habíamos mapeado el gen de la miostatina humana mediante hibridación in situ con fluorescencia (datos no mostrados).
Un toro azul belga de pura sangre que muestra el fenotipo de doble musculación.
Las similitudes en el fenotipo entre los ratones nulos de miostatina y la raza de ganado azul belga y las posiciones similares del mapa del gen de la miostatina y el locus mh sugirieron el homólogo bovino de la miostatina como un gen candidato para el locus mh. Para determinar si el gen de la miostatina bovina está mutado en la raza Azul Belga, se amplificaron por PCR los tres exones del gen del toro Azul Belga de pura raza mostrado en la Fig. 2, se subclonaron y se secuenciaron. La secuencia codificante de la miostatina del Belgian Blue era idéntica a la secuencia del Holstein, excepto por una deleción de nucleótidos 937-947 en el tercer exón (Fig. 3). Esta deleción de 11 nucleótidos provoca un cambio de marco que se prevé que dé lugar a una proteína truncada que termina 14 codones después del lugar de la mutación. Se espera que la deleción sea una mutación nula porque se produce sólo después de los primeros 7 aminoácidos de la región C-terminal, lo que resulta en una pérdida de 102 aminoácidos (aminoácidos 274-375). Esta mutación es similar a la mutación dirigida en ratones nulos de miostatina en los que se eliminó toda la región que codifica la proteína madura (2). Mediante el análisis de Southern blot, utilizando oligonucleótidos correspondientes a la secuencia de tipo salvaje o mutante, se encontró esta mutación en ambos alelos en 14/14 bovinos azul belga de sangre completa examinados (datos no mostrados).
Mutaciones de la miostatina en el ganado azul belga (izquierda) y piamontés (derecha) en comparación con el ganado Holstein de tipo salvaje. Los nucleótidos inmediatamente anteriores (A936) y posteriores (C948) a la deleción de 11 nucleótidos del Belgian Blue están marcados. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se indican a continuación y se numeran en relación con el tipo salvaje. La deleción de 11 nucleótidos en el Azul Belga (Δ937-947) está marcada con un recuadro, y la transición G1056A del Piamonte está marcada. Las letras en negrita indican los cambios de nucleótidos y aminoácidos. Las flechas identifican las localizaciones de las mutaciones en la secuencia codificante de la miostatina. El sombreado indica la secuencia señal (gris), la región pro (blanca) y la región C-terminal madura (negra).
También secuenciamos el gen de la miostatina en otra raza bovina, la piamontesa, en la que la doble musculación se produce con una frecuencia extremadamente alta (4). La secuencia piamontesa contenía 2 cambios de nucleótidos en relación con la secuencia holstein. Uno de ellos fue una transversión de C a A en el exón 1, que dio lugar a una sustitución conservadora de leucina por fenilalanina (aminoácido 94). La segunda fue una transición de G a A en el exón 3, que dio lugar a una sustitución de cisteína por tirosina en la región madura de la proteína (aminoácido 313) (Fig. 3). Mediante el análisis de Southern blot, esta mutación se encontró en ambos alelos en 10/10 bovinos piamonteses de doble musculatura examinados. Es probable que esta mutación provoque una pérdida completa o casi completa de la función, ya que este residuo de cisteína es invariable no sólo entre todas las secuencias de miostatina sino también entre todos los miembros conocidos de la superfamilia del factor de crecimiento transformante β (1). Se sabe que este residuo de cisteína es uno de los aminoácidos implicados en la formación de la estructura del nudo de cistina intramolecular en los miembros de esta superfamilia cuya estructura tridimensional se conoce (14-17). Además, cuando la cisteína correspondiente en la activina A (cisteína-44) fue mutada a alanina, la proteína mutante tenía sólo el 2% de la unión al receptor de tipo salvaje y de la actividad biológica (18).
Las posiciones similares en el mapa del gen de la miostatina y del locus mh y la identificación de mutaciones relativamente severas en el gen de la miostatina de dos razas diferentes de ganado vacuno de doble musculatura sugieren que estas mutaciones son responsables del fenotipo de doble musculatura. Para apoyar aún más esta hipótesis, analizamos el ADN aislado de 120 individuos de ganado de pura sangre o de otras 16 razas que no están clasificadas como de doble musculatura (11 Angus, 11 Charolais, 10 Holstein, 10 Brown Swiss, 10 Polled Hereford, 10 Gelbvieh, 9 Simmental, 9 Jersey, 9 Guernsey, 9 Ayrshire, 7 Limousin, 4 Brahman, 4 Polled Shorthorn, 4 Red Angus, 2 Chianina y 1 Texas Longhorn) para detectar la presencia de cada una de estas mutaciones (Fig. 4). Mediante el análisis de Southern blot, la sustitución de cisteína por tirosina presente en la raza piamontesa no se detectó en ninguno de los 120 individuos. La deleción de 11 nucleótidos presente en la raza Azul Belga se detectó en un alelo de un solo toro Angus Rojo no doblemente musculado. A este respecto, se ha sugerido que el fenotipo de doble musculatura que se observa ocasionalmente en muchas razas puede deberse a una única mutación o a muy pocas mutaciones que migraron a muchas de las razas europeas de ganado vacuno durante el desarrollo de las razas modernas (7). Nuestros resultados demuestran que las mutaciones de la miostatina que causan la doble musculación se han producido al menos dos veces en el ganado vacuno.
Hibridación Southern blot representativa que muestra la presencia de las secuencias mutantes belga azul y piamontesa sólo en las razas bovinas de doble musculatura. Los productos de PCR del exón 3 se hibridaron con sondas de oligonucleótidos que abarcaban la secuencia de tipo salvaje de la región de la mutación Azul Belga (fila superior), la mutación Azul Belga Δ937-947 (segunda fila), la secuencia de tipo salvaje en el nucleótido 1,056 (tercera fila) y la secuencia mutante Piamontesa en el nucleótido 1,056 (fila inferior). Las diferencias en la intensidad de las bandas reflejan las diferencias en las cantidades de productos de PCR cargados, según la tinción con bromuro de etidio (datos no mostrados). La homocigosidad para las mutaciones se observó sólo en el ganado de doble musculatura y no en ningún ganado convencional, como se describe en el texto (P < 0,001 por χ2).
Por último, para descartar la presencia de otras mutaciones de miostatina en las razas que no son de doble musculatura, determinamos la secuencia completa de la región codificante de la miostatina de 11 de estas razas (Angus, Charolais, Brown Swiss, Polled Hereford, Gelbvieh, Guernsey, Ayrshire, Limousin, Brahman, Polled Shorthorn y Texas Longhorn). Este análisis sólo reveló polimorfismos que eran cambios silenciosos en las secuencias codificantes o que estaban presentes en los intrones y en las regiones no traducidas.
A diferencia de lo que ocurre en los ratones, una mutación nula de la miostatina en el ganado vacuno provoca una reducción del tamaño de los órganos internos y sólo un modesto aumento de la masa muscular (20-25% en la raza Azul Belga en comparación con el 200-300% en los ratones deficientes en miostatina). Es posible que el ganado vacuno esté más cerca de un límite máximo de tamaño muscular tras generaciones de cría selectiva para obtener una gran masa muscular, a diferencia de los ratones, que no han sido seleccionados de forma similar. A este respecto, incluso en las razas bovinas que no son muy musculosas, la secuencia de la miostatina contiene dos diferencias de aminoácidos adyacentes no conservativas (EG frente a KE) en la región C-terminal, en comparación con todas las demás especies examinadas. Aunque se desconoce el significado funcional de estas diferencias, es posible que estos dos cambios representen un alelo parcial de pérdida de función que se fijó en la población durante muchos años de cría de ganado.
Para las aplicaciones agrícolas, el ganado de doble musculatura presenta algunas desventajas, a saber, la reducción de la fertilidad de las hembras, la menor viabilidad de las crías y el retraso en la maduración sexual (19). Sin embargo, en la raza Azul Belga, el aumento de la masa muscular y la mayor eficiencia alimentaria compensan en gran medida estos inconvenientes (20). El hecho de que una mutación nula en el gen de la miostatina en el ganado bovino dé lugar a animales que siguen siendo viables y fértiles y que producen carne de alta calidad demuestra el valor potencial de producir un aumento de la masa muscular en otros animales de carne como las ovejas, los cerdos, los pollos, los pavos y los peces mediante la alteración de la función de la miostatina. De hecho, el alto grado de conservación de la secuencia en animales que van desde los mamíferos hasta las aves y los peces sugiere que la función biológica de la miostatina se ha conservado ampliamente en todo el reino animal.