Iz se hidroliza lentamente a 2,2,4-triamino-5(2H)-oxazolona (Oz) (Fig. 1) en solución acuosa neutra, y su vida media es de 147 min en condiciones fisiológicas . Además, se detectan entre 2 y 6 moléculas de Oz por cada 107 bases de guanina en el ADN del hígado, y recientemente se ha demostrado que la cantidad de Oz aumenta significativamente en presencia de 5-metilcitosina. Por lo tanto, la influencia biológica de Oz en la replicación del ADN es probablemente mayor que la de Iz.

El fragmento de Klenow exo- incorpora adenina frente a Oz in vitro , y Oz provoca transversiones G:C-T:A en E. coli . En cambio, en nuestro sistema de reacción in vitro, el fragmento exo de Klenow incorpora adenina o guanina frente a Oz . Además, revelamos que las ADN polimerasas α, β, δ y ε incorporan cada una sólo guanina frente a Oz; las ADN polimerasas γ, κ y la ADN polimerasa IV de Sulfolobus solfataricus, además del fragmento de Klenow exo-, incorporan cada una guanina y adenina; la ADN polimerasa η incorpora guanina, adenina y citosina; las ADN polimerasas ζ y ι incorporan cada una guanina, adenina, citosina y timina; y REV1 incorpora citosina . Estos análisis indican que las ADN polimerasas, excepto REV1, incorporan guanina frente a Oz . Predecimos que Oz puede formar un par de bases estable con la guanina, y que este par de bases Oz:G tiene dos enlaces de hidrógeno y es planar (Fig. 3c) . Recientemente realizamos experimentos de desnaturalización térmica e informamos de que el par de bases Oz:G es más estable termodinámicamente que Oz:A, Oz:C y Oz:T .

Además, las ADN polimerasas α, β, γ, δ, ε, η, κ y ζ elongan cada una el cebador hasta su longitud completa a través de Oz . Así, Oz parece ser una lesión oxidada relacionada con la inducción de las transversiones G:C-C:G. En particular, la ADN polimerasa ζ elonga más allá de Oz con casi la misma eficiencia que más allá de G , pero no más allá de tetrahidrofurano (THF; un análogo del sitio abásico químicamente estable), 8-oxoG, o O 6-metilguanina . Estos datos indican que la ADN polimerasa ζ es una polimerasa de replicación eficaz y propensa a errores para Oz. Además, sólo REV1 incorpora citosina frente a Oz, y la frecuencia de inserción de citosina sigue el orden Oz > guanidinohidantoína (Gh) > THF > 8-oxoG . Dado que REV1 puede interactuar con las ADN polimerasas , los resultados colectivos hasta la fecha sugieren que REV1 junto con la ADN polimerasa ζ podría prevenir las transversiones G:C-C:G . Tales sistemas de prevención de mutaciones se observan en otras ADN polimerasas .

Reacción de los oligonucleótidos que contienen oz con las enzimas de reparación

Las células utilizan una serie de mecanismos para prevenir los efectos mutagénicos de los tipos de daños en el ADN descritos anteriormente, y cuentan con varias enzimas que reparan los daños en el ADN como la 8-oxoG .

Las enzimas formamidopirimidina ADN glicosilasa y endonucleasas III de E. coli extirpan Oz de los oligómeros de ADN de doble cadena . Además, las enzimas humanas NTH1 y NEIL1, que son homólogas de las endonucleasas III y VIII de E. coli, eliminan Oz con la misma eficacia con la que eliminan el 5-hidroxiuracilo, y su reactividad hacia Oz es mayor que hacia 8-oxoG . Dado que Oz es más sensible que 8-oxoG al tratamiento con piperidina, esta diferencia de reactividad depende de la fuerza del enlace N-glicosídico.

Analizamos las actividades de incisión de otras enzimas de reparación sobre Oz. La glicosilasa de dímeros de pirimidina del virus de Chlorella, que presenta una actividad de incisión hacia el dímero de pirimidina de ciclobutano, reacciona con el ADN de doble cadena que contiene Oz. Su reactividad hacia Oz es mayor que hacia 8-oxoG, lo que indica que la reactividad depende de la fuerza del enlace N-glicosídico, de forma similar a NEIL1 y NTH1 humanos. Sin embargo, esta enzima reparadora muestra una actividad moderada hacia Oz en comparación con su actividad hacia el dímero de ciclobutano-pirimidina.

La endonucleasa IV, una endonucleasa apurínica/apirimidínica, incide en Oz con una actividad observada de un tercio a un cuarto de la que tiene hacia el THF , pero con mayor eficacia que su actividad hacia Gh. Estos resultados sugieren que Oz puede ser más similar estructuralmente a un sitio abásico que Gh.

La endonucleasa V, que muestra actividad hacia los residuos de hipoxantina, también es activa hacia Oz. Esta actividad es menor que hacia la hipoxantina a altas concentraciones de endonucleasa V, pero la endonucleasa V reconoce a Oz de forma mucho más eficiente que a Gh. La endonucleasa V puede reconocer el uracilo pero no la timina, lo que sugiere que el grupo 5′-metilo es crítico para el reconocimiento por parte de la endonucleasa V . Como se ha descrito anteriormente, a diferencia de la estructura de anillo cerrado de Oz (Fig. 1), Gh tiene una fracción que sobresale del anillo, similar a la timina. Por lo tanto, la endonucleasa V puede reconocer Oz pero no Gh.

La OGG1 humana y la endonucleasa AP 1 no pueden extirpar residuos de Oz , y la uracilo-ADN glicosilasa 1 monofuncional selectiva no muestra actividad de incisión hacia Oz (datos no mostrados). La Mut Y de E. coli no puede actuar sobre las lesiones Oz:G y Oz:A (datos no mostrados). Oz es un sustrato débil para la reparación de escisión de nucleótidos humana porque el sitio dañado es menos voluminoso que el de los fotoproductos de pirimidina (6-4) pirimidona, lo que dificulta que XPC-RAD23B reconozca a Oz .

Los datos disponibles hasta la fecha indican que NEIL1 y NTH1 humanas son las enzimas de reparación más probables para Oz. Sin embargo, NEIL1 humano, NTH1, las endonucleasas III de E. coli y la formamidopirimidina ADN glicosilasa pueden extirpar Oz del ADN de doble cadena, independientemente del tipo de base opuesta a Oz . Si la base opuesta a Oz es adenina, guanina o timina antes de la reparación por escisión de bases, la información genética se altera en las siguientes replicaciones. Por lo tanto, puede haber enzimas desconocidas que puedan eliminar Oz con precisión de los oligonucleótidos en los que Oz está emparejado a una C, al igual que la OGG1 humana puede eliminar 8-oxoG. Alternativamente, como se mencionó anteriormente , la REV1-ADN polimerasa ζ puede prevenir las transversiones G:C-C:G.

¿Obstaculiza OzOz la síntesis de ADN por parte de las ADN polimerasas?

Las guaninas contiguas (GG), que existen en muchas regiones genómicas importantes como el oncogén K-ras , se oxidan más fácilmente que una sola guanina debido a su menor potencial redox . La oxidación de las secuencias GG en condiciones de alta oxidación da lugar a una lesión de guanina oxidada contigua. Anteriormente informamos de que IzIz se produce por la oxidación de GG en ADN de cadena simple y doble, lo que sugiere que la hidrólisis de estas moléculas Iz produce dos moléculas Oz contiguas (OzOz). Se espera que OzOz paralice la síntesis de ADN de forma más eficaz que una sola Oz y, por tanto, represente un daño más grave en el ADN que una sola Oz.

Nuestro análisis mostró que la ADN polimerasa κ no incorporó ningún nucleótido opuesto a OzOz . El fragmento Klenow exo- incorporó preferentemente una adenina opuesta a la 3′ Oz de las lesiones OzOz, REV1 incorporó citosina, y la ADN polimerasa β incorporó guanina . La ADN polimerasa α incorporó guanina, adenina y citosina frente a las lesiones 3′ de OzOz, y la guanina se incorporó más fácilmente que la adenina y la citosina . La ADN polimerasa ι incorporó ligeramente guanina, adenina y timina . Tanto si se incorpora una base como si no, estas polimerasas no pueden elongar el cebador hasta su longitud completa a través de OzOz .

En cambio, la ADN polimerasa η elongó el cebador hasta su longitud completa a través de las lesiones de OzOz con una eficiencia modesta en comparación con a través de las lesiones de dímero de pirimidina de ciclobutano, y la síntesis de la mayoría de las cadenas de ADN se detuvo en la 3′ o 5′ Oz de OzOz . Por el contrario, la ADN polimerasa ζ pudo elongar eficientemente el cebador hasta su longitud completa a través de OzOz , lo que sugiere que la ADN polimerasa ζ es una enzima importante para la síntesis de translesiones más allá de moléculas Oz simples y contiguas. Además, la ADN polimerasa ζ incorpora todos los nucleótidos opuestos tanto a la 3′ como a la 5′ Oz y es una ADN polimerasa propensa a errores de OzOz.

Fotooxidación en ADN cuádruplex

Las secuencias ricas en guanina, como los telómeros, pueden plegarse en estructuras cuádruplex . En el ADN de doble cadena, la oxidación de un electrón de la guanina en secuencias contiguas de guanina depende de la localización del orbital molecular de mayor ocupación (HOMO) . A diferencia del ADN de doble cadena, la 3′-guanina de d(TGGGGT) se oxida principalmente en el ADN cuadruplex, y el HOMO estimado se localiza en la 3′-guanina (Fig. 4b). Dado nuestro conocimiento actual del ADN de doble cadena y del ADN cuadruplex, la oxidación selectiva de un electrón de la guanina se produce en el HOMO localizado independientemente de la estructura del ADN.

El equilibrio propuesto y el HOMO de d(TGGGT)4. a Modelos de cuadruplexos G apilados. Los planos azules son guaninas y las bolas rojas son K+. b La localización del HOMO. Los HOMOs se calcularon en los niveles B3LYP/6-31G* . Estas figuras están adaptadas de los datos reportados previamente

Por otro lado, los productos de oxidación de la guanina dependen de la estructura del ADN. Por ejemplo, Iz es un producto importante en el ADN monocatenario, mientras que 8-oxoG y la dehidroguanidinohidantoína (Ghox) se forman principalmente en el ADN cuádruplex . Iz, 8-oxoG, Ghox y Gh se forman en el ADN de doble cadena, y también son productos de oxidación principales que se encuentran en el ADN monocatenario y cuádruplex.

El mecanismo de oxidación de la guanina en el ADN monocatenario, bicatenario y cuádruplex puede explicarse como sigue. La oxidación de un electrón de la guanina genera un catión radical de guanina (G-+), seguido de dos vías de degradación (Fig. 5). En una vía, el G-+ se desprotoniza en la posición N1, seguido de la generación de Iz. En otra vía, el G-+ es hidratado y desprotonado, seguido de la generación de 8-oxoG, Ghox y Gh. Existe un enlace de hidrógeno entre el protón N1 de G-+ y el O6 de la guanina en el ADN cuadruplex (Fig. 6a), y se forma un enlace de hidrógeno entre el protón N1 de G-+ y el N3 de la citosina en el ADN de doble cadena (Fig. 6b). Por lo tanto, la desprotonación de G-+ está significativamente inhibida en el ADN cuádruple y parcialmente inhibida en el ADN de doble cadena. Estimamos que la facilidad de desprotonación sigue el orden: ADN monocatenario > ADN bicatenario > ADN cuadruplex , y este orden explica las diferencias en los productos de oxidación en cada tipo de estructura de ADN.

Dos vías para la oxidación de la guanina

Desplazamientos de protones en (a) el par de bases G-+:G del ADN cuádruplex y en (b) el par de bases G-+:C del ADN de doble cadena

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