En la década de 1930 todavía se buscaba una forma de utilizar tanto la luz directa como la difractada desde todos los azimuts para obtener imágenes de buen contraste de objetos no teñidos que no absorben la luz. Las investigaciones de Frits Zernike durante este período descubrieron diferencias de fase y amplitud entre la luz de orden zerótico y la luz desviada que pueden ser alteradas para producir condiciones favorables para la interferencia y el aumento del contraste.

Los especímenes no teñidos que no absorben la luz se denominan objetos de fase porque alteran ligeramente la fase de la luz difractada por el espécimen, normalmente retrasando dicha luz aproximadamente 1/4 de longitud de onda en comparación con la luz directa no desviada que pasa a través o alrededor del espécimen sin verse afectada. Lamentablemente, nuestros ojos, así como la película de la cámara, son incapaces de detectar estas diferencias de fase. Para reiterar, el ojo humano sólo es sensible a los colores del espectro visible (variaciones en la frecuencia de la luz) o a los diferentes niveles de intensidad de la luz (variaciones en la amplitud de la onda).

En las muestras de fase, la luz directa de orden cero pasa a través o alrededor de la muestra sin desviarse. Sin embargo, la luz difractada por el espécimen no se reduce en amplitud como ocurre en un objeto que absorbe la luz, sino que es frenada por el espécimen debido al índice de refracción o al grosor del mismo (o ambos). Esta luz difractada, retrasada en aproximadamente 1/4 de longitud de onda, llega al plano de la imagen desfasada (también llamada desfasada) con la luz no desviada pero, en la interferencia, esencialmente sin disminuir su intensidad. El resultado es que la imagen en el nivel del ocular carece tanto de contraste que hace que los detalles sean casi invisibles.

Zernike logró idear un método -que ahora se conoce como microscopía de contraste de fase- para hacer que los objetos de fase no teñidos produzcan imágenes de contraste como si fueran objetos de amplitud. Los objetos de amplitud muestran un excelente contraste cuando la luz difractada y la directa están desfasadas (muestran una diferencia de fase) en 1/2 de una longitud de onda. El método de Zernike consistía en acelerar la luz directa en 1/4 de longitud de onda, de modo que la diferencia de longitud de onda entre la luz directa y la luz difractada para un espécimen de fase fuera ahora de 1/2 longitud de onda. Como resultado, la luz directa y la luz difractada que llegan al nivel de la imagen del ocular podrían producir una interferencia destructiva (véase la sección sobre la formación de imágenes para objetos absorbentes descrita anteriormente). Este procedimiento hace que los detalles de la imagen aparezcan más oscuros sobre un fondo más claro. Esto se denomina contraste de fase oscuro o positivo. En la figura 1 se muestra un esquema de la configuración básica del microscopio de contraste de fase.

Otro procedimiento posible, mucho menos utilizado, es disponer que la luz directa se ralentice en 1/4 de longitud de onda para que la luz difractada y la luz directa lleguen al ocular de forma escalonada y puedan interferir constructivamente. Esta disposición da lugar a una imagen brillante de los detalles del espécimen sobre un fondo más oscuro, y se denomina contraste negativo o brillante.

La microscopía de contraste de fases tuvo mucho éxito y acabó ganando una amplia aplicación, lo que le valió a Zernike la concesión del prestigioso premio Nobel de Física en 1953. La técnica de contraste de fases ha sido aclamada como el mayor avance de la microscopía en un siglo. El contraste de fase, al «convertir» especímenes de fase como el material vivo en especímenes de amplitud, permitió a los científicos ver detalles en objetos no teñidos y/o vivos con una claridad y resolución nunca antes logradas.

El método de Zernike implica la separación de la luz directa de orden cero de la luz difractada en el plano focal posterior del objetivo. Para ello, se coloca un anillo anular directamente debajo de la lente inferior del condensador en el plano focal delantero del mismo, conjugado con el plano focal trasero del objetivo. Cuando el cono de luz hueco del anillo atraviesa la muestra sin desviarse, llega al plano focal posterior del objetivo en forma de anillo de luz. La luz más débil difractada por el espécimen se extiende por todo el plano focal posterior del objetivo.

Si se permitiera que esta combinación, tal cual, avanzara hasta el plano de la imagen del ocular, la luz difractada estaría aproximadamente 1/4 de longitud de onda por detrás de la luz directa. En el plano de la imagen, la fase de la luz difractada estaría desfasada con respecto a la luz directa, pero la amplitud de su interferencia sería casi la misma que la de la luz directa. Esto daría lugar a un contraste muy escaso de la muestra.

Para acelerar la luz directa no desviada de orden cero, se instala una placa de fase con un cambiador de fase en forma de anillo unido a ella en el plano focal posterior del objetivo. La zona estrecha de la placa de fase es ópticamente más fina que el resto de la placa. Como resultado, la luz no desviada que pasa por el anillo de fase recorre una distancia más corta al atravesar el cristal del objetivo que la luz difractada.

Ahora, cuando la luz directa no desviada y la luz difractada se dirigen al plano de la imagen, están desfasadas 1/2 longitud de onda entre sí. La luz difractada y la directa pueden ahora interferir destructivamente, de modo que los detalles del espécimen aparecen oscuros sobre un fondo más claro (al igual que ocurre con un espécimen absorbente o de amplitud). Esta es una descripción de lo que ocurre en el contraste de fase positivo u oscuro.

Si la zona del anillo de cambio de fase de la placa de fase se hiciera más gruesa que el resto de la placa, la luz directa se frena en 1/4 de longitud de onda. En este caso, la luz de orden cero llega al plano de la imagen en paso (o en fase) con la luz difractada, y se produce una interferencia constructiva. La imagen aparece brillante sobre un fondo más oscuro. La imagen aparece brillante sobre un fondo más oscuro. Este tipo de contraste de fase se describe como contraste negativo o brillante.

Debido a que la luz no desviada de orden cero es mucho más brillante que la débil luz difractada, se deposita una fina capa metálica transparente absorbente en el anillo para que la luz directa y la difractada se equilibren mejor en cuanto a intensidad y así aumentar el contraste. Además, dado que la aceleración o ralentización de la luz directa se calcula sobre una longitud de onda de 1/4 de la luz verde, la imagen de fase aparecerá mejor cuando se coloque un filtro verde en la trayectoria de la luz (es preferible un filtro de interferencia verde). Dicho filtro verde también ayuda a que los objetivos acromáticos produzcan sus mejores imágenes, ya que los acromáticos están corregidos esféricamente para la luz verde.

Los accesorios necesarios para el trabajo de contraste de fase son un condensador de contraste de fase de subetapa equipado con ánulos y un conjunto de objetivos de contraste de fase, cada uno de los cuales tiene instalada una placa de fase. El condensador suele tener una posición de campo claro con un diafragma de apertura y una torreta giratoria de anillos (cada objetivo de fase de diferente aumento requiere un anillo de diámetro creciente a medida que aumenta el aumento del objetivo). Cada objetivo de fase tiene un anillo oscurecido en su lente posterior. Estos objetivos también pueden utilizarse para trabajos ordinarios con luz transmitida de campo claro con sólo una ligera reducción de la calidad de la imagen.