Cardellini tuvo su primera gran oportunidad en 1996, cuando consiguió un papel protagonista como Sarah en la serie infantil de acción real de los sábados de la ABC, Bone Chillers. A continuación, hizo apariciones como invitada en programas de máxima audiencia como Step by Step, Clueless, 3rd Rock from the Sun y Boy Meets World en el papel de Lauren, una chica que se interpone entre la pareja protagonista del programa. Cardellini protagonizó la primera temporada de la serie de AMC The Lot en 1999, y pasó el verano en Europa como parte de una producción en gira de Lancelot, una tragedia holandesa del siglo XIV.
Sus otros trabajos cinematográficos incluyen papeles en Dead Man on Campus, Strangeland, Good Burger, Legally Blonde, Brokeback Mountain (por la que fue nominada a los premios Gotham y Screen Actors Guild), y un papel protagonista en la película de Happy Madison Grandma’s Boy como Samantha. Fue la voz de Úrsula en el videojuego de rol Gladius, e interpretó la voz de Bliss Goode en la serie de animación de ABC The Goode Family. En 2007, Cardellini fue elegida para interpretar a la enamorada Clara en la miniserie de la CBS Comanche Moon, una precuela de Lonesome Dove de 1989.
En 2010 y 2011, Cardellini volvió a los escenarios con el grupo de comedia Dr. God en Los Ángeles y San Francisco, apareció en Kill the Irishman y Super, y protagonizó la película independiente Return. Apareció con miembros del reparto y productores de Freaks and Geeks y Undeclared en el Paley Center for Media PaleyFest el 12 de marzo de 2011. Desde el 15 de junio de 2012 hasta el 15 de febrero de 2016, fue la voz de Wendy en la serie de Disney Channel Gravity Falls.
Cardellini pone voz periódicamente al podcast y programa en directo The Thrilling Adventure Hour, en los segmentos Sparks Nevada: Marshal en Marte. En 2013, fue elegida para interpretar a Sylvia Rosen, un interés amoroso de Don Draper en Mad Men. Por su actuación en Mad Men, recibió una nominación al Premio Primetime Emmy a la Actriz Invitada Sobresaliente en una Serie Dramática. A partir de 2015, se unió a Kyle Chandler en una nueva serie dramática de Netflix, Bloodline, de los creadores de Damages. La serie fue cancelada en 2016, y terminó después de su tercera temporada. Ese mismo año, también tuvo un papel protagonista como Sara Whitaker en la película de comedia Daddy’s Home. En 2017, retomó su papel en la película secuela Daddy’s Home 2.
En agosto de 2018, Cardellini fue elegida para coprotagonizar junto a Christina Applegate la serie de comedia oscura de Netflix Dead to Me. Se estrenó el 3 de mayo de 2019. Por su interpretación, recibió elogios de la crítica y una nominación al Premio Primetime Emmy a la Actriz Principal Sobresaliente en una Serie de Comedia.
En 2019, protagonizó la película de terror La maldición de la Llorona.