Después de trabajar en el Hospital de Nueva Inglaterra durante 15 años, Mahoney fue aceptada en su escuela de enfermería en 1878 a la edad de 33 años. El programa de 16 meses era muy riguroso y consistía en jornadas de 16 horas. Cuando las estudiantes no trabajaban en las salas del hospital o hacían tareas privadas en los hogares de los pacientes, debían asistir a clases y conferencias durante todo el día. Sólo cuatro de las 42 estudiantes originales que comenzaron el programa tuvieron la resistencia y la fuerza de voluntad para completar el curso. Cuando recibió su diploma en 1879, se convirtió en la primera enfermera profesional estadounidense de raza negra y pasó a engrosar las filas de las enfermeras famosas de la historia.

Mahoney se dedicó a la enfermería privada durante la mayor parte de sus 30 años de carrera debido a los prejuicios raciales que aún prevalecían en la enfermería pública. Muchos de sus pacientes procedían de familias prestigiosas y quedaron impresionados por su habilidad y profesionalidad. Al final de su carrera, fue directora de un orfanato para negros en Nueva York. Se dedicó a su trabajo y nunca se casó.

En 1896, Mahoney se unió a la recién formada y principalmente blanca Nurses Associated Alumnae of the United States and Canada, más tarde conocida como American Nurses Association (ANA). Debido a su lentitud para aceptar a miembros negros, ayudó a formar la Asociación Nacional de Enfermeras Graduadas de Color (NACGN) y habló en su primera convención en 1909. En ese momento, abordó las desigualdades para los afroamericanos en la educación de enfermería y pidió una manifestación en el Hospital de Nueva Inglaterra. La convención la apoyó incondicionalmente, la eligió capellán y le concedió la afiliación vitalicia. Durante muchos años, trabajó para reclutar enfermeras de minorías para que se unieran a la organización. En gran parte gracias a sus esfuerzos, el número de enfermeras afroamericanas se duplicó de 1910 a 1930.