Resultados y discusión
La estructura tridimensional de Mal d 1.0101 consiste en una lámina β antiparalela curvada de siete filamentos (β1-β7) que abarca una hélice larga en el extremo C de la proteína (α3) y dos hélices cortas consecutivas (α1, α2) (Figura 11). Los bordes de la lámina β están formados por las hebras β1 y β2, que están conectadas por las hélices α1 y α2 que forman un soporte en forma de V para la parte C-terminal de la hélice α3. En total, Mal d 1 contiene aproximadamente un 35% de estructura de lámina β y un 25% de estructura helicoidal, lo que coincide con las estimaciones de estructura secundaria obtenidas mediante infrarrojos y dicroísmo circular.33-35 Al igual que en otras proteínas de la familia PR-10, las hebras β2 y β3 están conectadas por un motivo de bucle rico en glicina (Gly46-Asn47-Gly48-Gly49-Pro50-Gly51). De la Figura 11B se desprende que en nuestro conjunto estructural de RMN de Mal d 1, los elementos de la estructura secundaria están muy bien definidos y son conformacionalmente homogéneos en los 20 modelos estructurales. Sólo se observan niveles ligeramente elevados de heterogeneidad conformacional en algunos de los bucles expuestos al disolvente que conectan los elementos de la estructura secundaria y el extremo C de la proteína.
Una característica peculiar del pliegue de la PR-10 es la gran cavidad interna.En Mal d 1.0101, el volumen de esta cavidad36 es de aproximadamente 2230 Å3, que es comparable en tamaño a los de otras proteínas PR-10.5 Al igual que en el alérgeno del polen de abedul Bet v 1 y otros alérgenos alimentarios homólogos, en Mal d 1 la mayoría de los aminoácidos que forman la superficie de la cavidad son hidrofóbicos (Figura 22). Una gran proporción de la superficie de la cavidad interior está formada por residuos de aminoácidos de la lámina β cuyas cadenas laterales hidrofóbicas se encuentran en el interior de la proteína (Ile56 (β3), Val67(β4), Ile71 (β4), Tyr81 (β5), Tyr83 (β5),Leu85 (β5), Ile98 (β6), Tyr100 (β6), Ile113 (β7))junto con residuos orientados hacia el interior en la larga hélice anfifílicaα3 (Val132, Val134, Ala139, Leu142, Phe143, Ile146), las dos hélices cortas α1 (Phe22, Val23) y α3 (Ala26, Ile30), y las regiones de bucle (Ile38, Phe58, Tyr64, Ala90). Además, algunas cadenas laterales polares y cargadas se encuentran en el interior de la molécula y forman parte de la superficie de la cavidad, como Asp27 (α2), His69(β4), Ser115 (β7) y Lys138 (α3), de modo que la propia cavidad es en realidad anfifílica, como se ha señalado anteriormente para el principal alérgeno del polen de abedul, Bet v 1.37 En las estructuras cristalinas de otras proteínas PR-10 la cavidad está ocupada por agua, moléculas de ligando anfifílico o componentes del tampón de cristalización.5 En el caso de Mal d 1, se desconoce actualmente si los ligandos se unen específicamente a la cavidad o cuál podría ser la función biológica de la unión del ligando.
(A) Cavidad interna deMal d 1.0101, coloreada según el potencial lipofílico como se implementa en MOE,32 donde las regiones hidrofílicas se colorean en azul y las regiones lipofílicas se colorean en amarillo. (B) Representación de la superficie de la estructura de solución de menor energía de Mal d 1.0101. Las dos entradas anfifílicas a la cavidad interna se indican como ε1 (entre el extremo N-terminal de la hélice α3 y los bucles que conectan las hebras β3-β4 y β5-β6) y ε2 (entre el borde de la lámina β y el extremo C-terminal de la hélice α3).
A la cavidad interna de Mal d 1 se puede acceder por dos aberturas (Figura 22). Una entrada al interior de la proteína, ε1, está formada por residuos en la mitad N-terminal de la hélice α3 (His131, Val134) junto con los bucles que conectan las hebras β3-β4 (Gln63, Tyr64) y las hebras β5-β6 (Asp89). Juntos, estos aminoácidos crean una ruta de acceso anfifílica al interior de la proteína. Una segunda entrada anfifílica, ε2, está presente en el borde de la hoja β entre la hélice α3(Lys136, His140, Lys144 y Glu147) y la hebra β1 (Asn7, Phe9 y Ser 11). En las estructuras de solución de RMN de Mal d 1 esta ruta de acceso está parcialmente obstruida por la cadena lateral de His140. Cabe destacar que también se han descrito entradas a la cavidad interna en lugares similares para otros miembros de la familia de proteínas PR-10.5
La figura 33 muestra una comparación de Mal d 1 con Bet v 1 y los alérgenos alimentarios relacionados con el polen de abedul de la familia PR-10 cuyas estructuras se han determinado hasta ahora. A la luz de la reactividad inmunológica observada entre Mal d 1 y el principal alérgeno del polen de abedul, Bet v 1, la comparación estructural de estas dos proteínas es de especial interés. La diferencia entre Mal d 1.0101 y la isoforma hiperalérgica Bet v 1.0101 (61% de identidad de secuencia) del alérgeno del polen de abedul es de 2,13 Å (1,70 Å para los elementos de estructura secundaria). Cabe destacar que Mal d 1 y Bet v 1 difieren en longitud en un aminoácido, y se han hecho presunciones divergentes sobre la ubicación de la brecha en Mal d 1. Sobre la base de las alineaciones de la secuencia de los alérgenos alimentarios PR-10, se ha propuesto que el bucle justo antes39,40 o justo después4,34,41,42 de la cadena β7 es un residuo más corto en Mal d 1. Nuestra estructura de solución muestra que el bucle justo antes de la hebra β7 es el que es más corto en Mal d 1.0101. Los filamentos β6 (Glu96-Val105 tanto en Mal d 1.0101 como en Bet v 1.0101) y β7 (Ser111-Thr121 en Mal d 1.0101 y Ser112-Thr122 en Bet v 1.0101) ocupan posiciones idénticas y tienen patrones de enlace de hidrógeno iguales en las láminas beta antiparalelas de estas proteínas. Están conectados a través de bucles que consisten en cuatro residuos (Cys-Gly-Ser-Gly en Mal d 1) y cinco residuos (Thr-Pro-Asp-Gly-Gly en Bet v 1), respectivamente, lo que produce una pequeña diferencia estructural en estos segmentos de bucle entre las dos proteínas.
Comparación de los alérgenos alimentarios y vegetales PR-10 con estructuras conocidas.(A) Superposición de la estructura de energía más baja de Mal d 1.0101 (verde, código de acceso PDB 5MMU) con las estructuras del principal alergeno del polen de abedul Bet v 1.0101 (azul, 4A88), el alergeno de la zanahoria Dau c 1.0103 (naranja, 2WQL), el alergeno del apio Api g 1.0101 (gris, 2BK0), el alérgeno de la soja Glym 4.0101 (amarillo, 2K7H), el alérgeno de la fresa Fra a 1E (rojo, 2LPX), y el alérgeno de la cereza Pru av 1.0101 (morado, 1E09). (B) Alineación de secuencias múltiples de estos alérgenos obtenida con Clustal Omega.53 Los aminoácidos están marcados con asteriscos (idénticos), dos puntos (conservados) y puntos (semiconservados). Se indican los elementos de la estructura secundaria presentes en Mal d 1.0101.
Se sabe que Mal d 1 tiene una tendencia a la quimerización mediada por cisteína, como se ha demostrado para la isoforma Mal d 1.0108 mediante electroforesis en gel no reductor y cromatografía de exclusión por tamaño.35 Al igual que Mal d 1.0108, la isoforma Mal d 1.0101 contiene un único cisteinerésido, Cys107. En la estructura tridimensional en solución de Mald 1.0101, Cys107 se encuentra en el extremo C-terminal de la cadena β7, con su cadena lateral orientada hacia la superficie de la proteína. Para comprobar el estado de oligomerización de Mald 1.0101 en las condiciones que empleamos para la determinación de la estructura por RMN (pH 6,9, 10 mM de sodio-fosfato, 14 mol equivalentes de ácido l-ascórbico, 298 K), realizamos experimentos de difusión por RMN de gradiente de campo pulsado. Obtuvimos un valor de 21,6 ± 0,8 Å para el radio hidrodinámico de Mal d 1.0101, que es comparable al radio hidrodinámico del Bet v1.0101 monomérico (20,1 Å) en condiciones experimentales similares.21 Esto es coherente con nuestra observación de que, utilizando el mismo tampón, Mal d 1.0101 eluye de una columna de exclusión por tamaño con un tiempo de retención que es prácticamente idéntico al de Bet v1.0101. Estos resultados se verificaron además mediante espectrometría de masas FT-ICR, que muestra que Mal d 1.0101 no forma dímeros ni agregados de orden superior.
La estructura en solución de RMN de Mal d 1 muestra que esta proteína consiste en una hoja β antiparalela muy curvada y tres hélices α que forman una gran cavidad interna, muy similar a la de otras proteínas PR-10.5 Esto concuerda con la reactividad cruzada inmunológica observada entre Mal d 1 y el principal alérgeno del polen de abedul, Bet v 1, así como otros alérgenos alimentarios de la familia de proteínas PR-10.4,43 En la mayoría de los pacientes, Bet v 1 es el agente sensibilizador, mientras que los anticuerpos IgE específicos de Bet v 1 reaccionan posteriormente de forma cruzada con Mal d 1 y provocan una respuesta alérgica, como se refleja en la observación clínica de que la alergia a la manzana se desarrolla sólo después de la aparición de la polinosis de abedul.44
En esta línea, los experimentos de inhibición cruzada de Mal d 1 con suero de pacientes alérgicos a la manzana mostraron que Mal d 1 comparte epítopos IgE con el principal alérgeno del polen de abedul, Bet v 1.4,43 Desde una perspectiva estructural, se dispone de información limitada sobre la naturaleza exacta de los epítopos de unión de Mal d 1 y Bet v 1. La información estructural detallada sobre un epítopo de células B secuencialmente discontinuo (es decir, conformación) del epítopo de células B en Bet v 1 se obtuvo mediante la cocristalización de la isoforma particular Bet v 1.0112 con un fragmento de unión a antígeno (Fab) derivado del anticuerpo monoclonal murino IgG BV16.45 Este epítopo está formado por el segmento entre Glu42 y Thr52 (incluyendo el motivo de bucle rico en glicina entre las cadenas β2 y β3), junto con Arg70, Asp72, His76, Ile86 y Lys97 de Bet v 1, cubriendo aproximadamente el 10% (≈900 Å2) de toda la superficie de la proteína. La unión de BV16 a este epítopo reduce considerablemente las interacciones suero-IgE, lo que indica que la IgE y la IgG monoclonal BV16 compiten por superficies de unión superpuestas en Bet v 1.46 Además, la mutación de un residuo central (Glu45→Ser) redujo significativamente la capacidad de unión a IgE de Bet v 1, lo que confirma la importancia de este epítopo concreto para las interacciones con IgE.46
La figura 44A muestra la superficie de interacción molecular que corresponde al epítopo BV16 en el alérgeno de la manzana. En Mal d 1 estos residuos forman un parche de superficie contiguo junto con un residuo algo distal (Glu76), similar en forma y tamaño al epítopo BV16 de Bet v 1. Además, los aminoácidos contribuyentes se conservan en gran medida entre Mal d 1 y Bet v 1. Trece de los 16 aminoácidos del epítopo BV16 son idénticos, mientras que sólo 3 residuos son diferentes en Mal d 1.0101 y Bet v 1.0101 (Figura 44B). Estos datos proporcionan una justificación estructural para la reactividad cruzada observada entre el polen de abedul y los alérgenos de la manzana. Curiosamente, los estudios de mutación indican que la capacidad de Mal d 1 para unirse a la IgE sérica de pacientes con alergias al polen de abedul puede aumentarse incrementando la similitud del epítopo BV16 en Mal d 1 con el de Bet v 1, lo que indica que estos aminoácidos están realmente implicados en la unión de Bet v 1 específica a Mal d 1.39
(A) Epítopos conformacionales de Mal d 1. Los residuos de aminoácidos que corresponden a la superficie de interacción molecular entre el IgG monoclonal BV16 y Bet v 1.0112 (residuos Glu42-Thr52, Arg70, Asp72,Glu76, Ile86 y Lys97 en Mal d 1.0101) están coloreados en azul.45 Las posiciones de aminoácidos que han demostrado ser cruciales para el reconocimiento de IgE de Mal d 1 en los análisis mutacionales (Thr10, Ile30,Thr57, Ser111, Thr112, e Ile113) se muestran en verde (Ile30 e Ile113 se encuentran en el interior de la proteína y no contribuyen a la superficie).13,34 (B) Similitudes de aminoácidos entre Bet v 1.0101 y Mal d 1.0101 utilizando un gradiente de color desde el lila (muy similar) hasta el cerceta (muy diferente). Los residuos del epítopo que son diferentes entre Bet v 1.0101 y Mal d 1.0101 están marcados. Las similitudes se calcularon sobre la base de las puntuaciones de la matriz de sustitución (BLOSUM62) tal y como se implementó en MOE.32
Es probable que Mal d 1 contenga más de un único epítopo conformacional.47 Se han identificado varias posiciones de aminoácidos que son relevantes para el reconocimiento de IgE mediante análisis mutacional.13,34 En el caso de un mutante de cinco puntos de Mal d 1.0108 (Thr10→Pro, Ile30→Val, Thr57 →Asn, Thr112→Cys, e Ile113→Val) se encontró una capacidad notablemente reducida de unión de IgE específica de Mald 1 in vitro.34 Las pruebas de punción cutánea en pacientes alérgicos a la manzana que comparaban Mal d 1 de tipo salvaje con el mutante de cinco puntos mostraron además una capacidad significativamente menor de la proteína mutante para inducir reacciones cutáneas in vivo.48 Otros experimentos mostraron que el nivel de reconocimiento de células T de Mal d 1 de tipo salvaje se conserva en el mutante de cinco puntos.34 Dado que es probable que estos cinco aminoácidos estén implicados en las interacciones IgE no sólo en Mal d 1 sino también en Bet v 1, podrían formar parte de epítopos comunes de reacción cruzada en estos dos alérgenos.49 Esto lo corroboran los estudios de mutación, que mostraron que los tramos de péptidos que abarcan estos residuos están realmente implicados en la reactividad cruzada inmunológica entre Mald 1 y Bet v 1.50 Además, en un estudio independiente, se identificó que Ser111 es esencial para la unión de IgE a Mal d 1, y una mutación Ser111→Cys dio como resultado una afinidad significativamente reducida para IgE en experimentos de inmunotransferencia.13
La Figura 44A muestra que estos seis residuos están bastante dispersos en la superficie de la proteína Mal d 1 y que ninguno de estos aminoácidos se solapa con el epítopo delBV16. Los aminoácidos Thr10, Ser111 y Thr112 forman un parche común en la superficie de la proteína, mientras que Thr57 se encuentra aproximadamente a 37-39 Å de distancia y cerca del epítopo BV16. Teniendo en cuenta que un epítopo de tamaño típico (∼600-900 Å2)39 y de forma circular tendría una longitud de arco de 28-34 Å en la superficie de Mal d 1, los residuosThr10, Ser111 y Thr112 están probablemente demasiado lejos de Thr57 para formar parte de un epítopo de unión común. Los dos residuos restantes, Ile30 e Ile113, no llegan a la superficie de la proteína en Mal d 1. Mientras que Ile113 está cerca en el espacio del parche Thr10-Ser111-Thr112, su cadena hidrofóbica apunta hacia el interior de la proteína, donde participa en un pequeño núcleo hidrofóbico situado en el extremo interior de la cavidad de la proteína (entre las hélices α1 y α3 y la hoja β). El residuo Ile30 también se encuentra en el interior de la proteína con su cadena lateral alifática formando parte de la cavidad interna y no contribuye a la superficie de la proteína.
De hecho, debido a que el bucle entre las hebras β6 y β7 es más corto en un residuo en Mal d 1 que en Bet v 1, Ser111 y Thr112 de β7 en Mal d 1 ocupan las posiciones β7 de Ser112 e Ile113 en Bet v 1. El parche de superficie formado por Thr10, Ser111, yThr112 en Mal d 1 parece ser por tanto menos hidrofóbico que el correspondiente parche de superficie en Bet v 1 (Thr10, Ser112, e Ile113). De hecho, también la superficie de la proteína que rodea a estos tres residuos muestra un nivel de similitud considerablemente menor entre Mal d 1.0101 y Bet v 1.0101 que otras partes de la superficie de la proteína, como puede verse en la figura 44B. Por otra parte, se ha observado que la epitopecoincidencia entre Bet v 1 y Mal d 1 puede ser limitada,47 como lo ejemplifica un estudio reciente que describe el aislamiento de la unión de IgE humana a Bet v 1 pero no a Mal d 1.51 Además, diferentes isoformas de Mal d 1 contienen sustituciones de aminoácidos dentro de las superficies de interacción potenciales de IgE,39 lo que sugiere que pueden influir en la reacción inmunológica.
Está claro que los datos estructurales de alta resolución proporcionan la base para determinar y comparar los detalles estructurales de los epítopos de unión (de reacción cruzada) en las proteínas alergénicas. Además, el injerto de epítopos conformacionales mediante la transferencia de tramos de residuos entre alérgenos homólogos se ha convertido en una valiosa herramienta experimental. El injerto de epítopos se utilizó para caracterizar el papel del epítopo BV16 en Mal d 1 mediante la recreación de este epítopo en la superficie de Mal d 1, confirmando su importancia para la unión de IgE y la reactividad cruzada con Bet v 1.39 En un enfoque ortogonal, se transfirieron a Betv 1 varios tramos de Mal d 1 que abarcaban residuos cruciales para la unión de IgE para investigar el papel de estos segmentos estructurales en la reactividad cruzada,50 y se crearon quimeras de Bet v 1 y Mal d 1 para asignar el epítopo de una IgE monoclonal humana, que se aisló de una biblioteca de fagos, al extremo C de Bet v 1.51 Además, el injerto de epítopos proporciona acceso a alérgenos quiméricos con propiedades antigénicas ajustadas, como capacidades de unión a IgE reducidas, para el diagnóstico de alergias basado en moléculas y la inmunoterapia específica.52 El conocimiento de los detalles estructurales de estos elementos alergénicos es necesario para generar quimeras con pliegues correctos, ya que la transferencia de tramos de estructura secundaria (parcialmente) no coincidentes entre diferentes alérgenos puede ser la razón de la pérdida de pliegues de la proteína y, en consecuencia, de la reducción de las capacidades de unión a IgE.41 La estructura tridimensional de Mal d 1.0101 presentada aquí proporciona la base biofísica para dilucidar los detalles moleculares de la reactividad cruzada inmunológica con gran detalle.