DISCUSIÓN
En este estudio, presentamos estructuras de solución SAXS para Hb y Hb conjugada con dos o seis a siete copias de PEG de 5-kD. Este es el primer ejemplo de una determinación estructural 3D de una hemoglobina conjugada con PEG, aunque a baja resolución. Los hallazgos más importantes de este estudio son: i), la conjugación con PEG no induce ninguna distorsión grosera de la estructura terciaria de la Hb (a esta resolución), pero su estructura cuaternaria parece compactada; ii), parte de las cadenas de PEG entra en las cavidades entre las subunidades de la Hb, parte permanece cerca de la superficie de la proteína, y el resto sobresale de la superficie; iii), la PEGilación cambia la molécula esférica de Hb en una estructura alargada con dos o seis PEGs conjugados; iv), la conjugación de PEG conduce a la repulsión entre las moléculas de Hb PEGiladas causada por la capa de PEG que rodea la proteína Hb, que se manifiesta por un marcado efecto de concentración en los datos SAXS.
La dispersión experimental de la Hb se ajusta bien a la curva calculada a partir de la estructura cristalina de la oxiHb, mientras que la estructura cristalina de la desoxiHb arroja un peor ajuste. Tanto P5K2 como P5K6 se conjugan en Cys-β93 adyacente al His-β92 proximal, que es el único residuo en las subunidades β de Hb directamente coordinado con el hierro hemo. Parece probable que la unión de un PEG de 5 kD provoque distorsiones estructurales locales y menores del bolsillo del hemo de la subunidad β que no son detectables a esta resolución (∼12 Å). Esto se ve apoyado por estudios de cinética de pérdida de hemo que son 5 veces mayores para la subunidad β de P5K6 en comparación con la Hb no conjugada, mientras que las subunidades α muestran una cinética similar a la Hb (8). En consonancia con esta interpretación, los estudios de RMN de 1H de una Hb conjugada con PEG, cuya estructura química es similar a la de la P5K6 estudiada aquí, mostraron un desplazamiento de la histidina proximal de las subunidades β pero no de las α (28). Además, los residuos en la vecindad de la Cys-β93 están localizados en una región conformacionalmente plástica que está directamente relacionada con las propiedades alostéricas de la Hb (29,30).
La modificación de los residuos Cys-β93 con N-etil maleimida por sí sola provoca una pérdida de cooperatividad, y este efecto, junto con la compactación de la estructura cuaternaria, puede explicar la aparente pérdida de cooperatividad en Hemospan (5). El movimiento cuaternario podría estar restringido, dando lugar a una transición parcial entre los estados R y T o a una estructura cuaternaria intermedia. Tal efecto se ha considerado previamente para interpretar la cinética de la unión del O2 al Hemospan (7).
Dado que las porciones de gran ángulo de dispersión de la Hb y la PEG-Hb coinciden, pueden excluirse cambios significativos en la estructura terciaria/secundaria debidos a la PEGilación, y nuestros resultados apuntan por tanto a una estructura cuaternaria más compacta de la proteína PEGilada. Esto puede explicarse por una deshidratación parcial de las interfaces intersubunitarias causada por las cadenas de PEG, que están, de forma bastante inesperada, parcialmente localizadas en el interior del PEG-Hbs. La estructura cuaternaria de la oxihb crea una cavidad central entre las cuatro subunidades de la hemoglobina. La cavidad puede albergar al menos 80 moléculas de agua, como se muestra en la estructura cristalina de alta resolución de la oxihb (27). En consecuencia, el volumen es suficiente para que el PEG entre en la interfaz intersubunidad y desplace las moléculas de agua situadas en el interior del tetrámero. Además, se sabe que el PEG causa deshidratación y se utiliza a menudo como cosolvente para la cristalización de proteínas. Junto con el desplazamiento de las moléculas de agua situadas en la cavidad central, una deshidratación general puede contribuir a la estructura cuaternaria compacta del PEG-Hbs. Esta conclusión es coherente con las simulaciones de dinámica molecular que han mostrado una correlación entre la extensión de la PEGilación y el volumen molecular del PEG-Hb, con el correspondiente desplazamiento de las moléculas de agua de la estructura de la Hb (31).
Como la mayor parte de las cadenas de PEG se localizan fuera de la Hb, nuestros resultados coinciden con estudios anteriores que muestran que el PEG se excluye preferentemente de las proteínas por exclusión estérica (32). Además, pero en competencia con las fuerzas de exclusión, se ha demostrado que el PEG interactúa con los residuos no polares de la superficie de las proteínas (32), y se ha informado de la interacción del PEG de 5 kD con los grupos hidrofóbicos de la superficie del citocromo c (33). La puntuación de hidrofobicidad para la Hb se calculó según Kyte y Doolittle (34) (Fig. 6), mostrando los números de residuos alineados con los segmentos helicoidales. Una región de particular interés en las posibles interacciones PEG-Hb es sobre las hélices G-H relativamente hidrofóbicas en los contactos de empaquetamiento α1β1 entre dímeros. Nuestros modelos muestran interacciones superficiales de PEG con Hb, aunque la resolución es insuficiente para definir los residuos de Hb implicados o su polaridad. El análisis de los espectros SAXS registrados a una concentración de proteína relativamente alta muestra un claro efecto de concentración tanto para P5K2 como para P5K6, mientras que este efecto está casi ausente en la Hb no conjugada. Como cabía esperar, el efecto de la concentración es más pronunciado para P5K6 que para P5K2, lo que sugiere que la introducción de cadenas adicionales de PEG da lugar a un mejor apantallamiento de la molécula de Hb, lo que también concuerda con los cálculos de dinámica molecular de las Hbs teóricas conjugadas con PEG (31).
Trama de hidrofobicidad para la Hb (34). La puntuación de hidrofobicidad se muestra para los números de residuos alineados con los segmentos helicoidales de la subunidad.
Intuitivamente, uno esperaría que las Hbs con PEG tuvieran la misma forma que la Hb sin PEG, pero aquí mostramos que la forma de una proteína con PEG no está definida por la de la proteína central. La forma no esférica de la solución de la PEG-Hbs no se había previsto y proporciona nueva información para calcular las constantes de difusión de la PEG-Hb mediante la ecuación de Stokes-Einstein. Hemos informado de simulaciones del transporte de oxígeno por Hbs libres de células, incluido el PEG-Hb, donde se demostró que la difusión molecular de la Hb es un factor crítico en el transporte global de oxígeno (35). Aunque la conclusión se mantiene, ese estudio utilizó la suposición simplificadora de que las moléculas de Hb eran esféricas. Dado que la estructura de la solución SAXS contradice esta suposición, ahora se pueden emplear las dimensiones moleculares correctas para proporcionar simulaciones más precisas.
Además, aunque tanto P5K2 como P5K6 tienen formas y dimensiones generales similares, la diferencia en el efecto repulsivo de las partículas en solución proporciona una propiedad altamente crítica que puede explicar algunos de los efectos positivos de las Hbs PEGiladas in vivo. La generalidad de estas observaciones puede atribuirse a las cadenas de PEG unidas y sugiere que el efecto de concentración es una consecuencia general de la conjugación con PEG. En consecuencia, in vivo, se puede plantear la hipótesis de que este efecto no sólo impide las interacciones intermoleculares entre las proteínas adyacentes conjugadas con PEG, sino también entre las proteínas conjugadas y no conjugadas o incluso las estructuras celulares.
A menudo se asocian varios beneficios generales, como el aumento del tiempo de retención intravascular, la disminución de la inmunogenicidad y la mejora de la solubilidad, con la unión de un polímero de PEG a una proteína. Por ejemplo, la unión de un polímero de PEG ramificado de 40 kDa al interferón-β-1b mejoró notablemente su vida media circulante, pasando de 1,1 h para la proteína no conjugada a 9,4 h para el fármaco conjugado con PEG; además, la unión de PEG disminuyó drásticamente la inmunogenicidad de la proteína y la tendencia a la agregación (4). La capacidad de la PEG-Hb para excluir otras proteínas o células dentro de su volumen excluido es particularmente crítica en el diseño de terapias de oxígeno. Los productos basados en la hemoglobina se están optimizando para ampliar el tiempo de circulación, al tiempo que se minimiza o elimina la toxicidad. Este resultado es coherente con la prolongación de la vida media circulatoria de Hemospan, que es de ∼20 h en ausencia de hemoglobinuria (14), en comparación con la rapidísima eliminación renal de la Hb no modificada y libre de células (36). La prolongación del tiempo de circulación de Hemospan puede surgir si no se une al receptor CD163 de los macrófagos, un eliminador de Hb que muestra una unión progresivamente decreciente de las Hbs polimerizadas con el aumento del tamaño (37). Se están realizando estudios con Hemospan en este sistema. Además, la repulsión de la PEG-Hb por parte de otras células inmunitarias puede ser fundamental para evitar respuestas inflamatorias. Las teorías predominantes sobre la vasoconstricción inducida por la hemoglobina libre de células son que las moléculas de Hb entran en estrecha aproximación con el endotelio (38) o se extravasan a través del endotelio (39), lo que haría que la eliminación de NO fuera más eficiente, provocando así un aumento del tono vascular y efectos secundarios negativos de hipertensión y disminución de la perfusión (40). Sigue siendo una especulación en este momento, pero la naturaleza repulsiva de la modificación de PEG puede reducir su interacción con el glicocálix de la superficie de las células endoteliales; por lo tanto, el efecto repulsivo proporciona una explicación para la menor vasoactividad con Hemospan (10).
Estos nuevos conocimientos de este análisis SAXS pueden utilizarse ahora para diseñar PEG-Hbs para obtener efectos de repulsión máximos u óptimos y conformaciones de partículas y PEG. Las fuerzas de repulsión intermolecular aumentan sustancialmente con la masa total de los PEGs conjugados con la misma longitud del polímero (10 vs. ∼30 kD para P5K2 frente a P5K6), un efecto que no se predijo por los cambios en la forma y/o dimensiones moleculares. Así, las conformaciones en solución de los PEG conjugados, que incluyen su interacción con la Hb, otros polímeros de PEG y las capas de agua circundantes, deben desempeñar un gran papel en el efecto de repulsión.
Las longitudes efectivas de los PEG se definen por la dimensión Flory, RF, que se determina a partir de la longitud efectiva de una unidad de oxietileno, a = 3.5 Å (41), y el número de unidades por polímero, N (42-44):
Las dimensiones relativas de RF y la distancia entre los sitios de injerto de PEG, DG, en una superficie determinan la estructura secundaria del polímero de PEG injertado: para DG > RF, el polímero de PEG es capaz de plegarse sobre sí mismo sobre la superficie injertada, dando una conformación de «seta»; para DG < RF, los PEG se extienden debido a las interacciones estéricas entre las cadenas de PEG para formar una conformación de «cepillo»; y en DG ≈ RF, los PEG se encuentran en una fase de transición de «seta a cepillo» (45). Para el PEG de 5-kD, N = 113 y RF ∼ 60 Å. Dado que la media circunferencia máxima DG en la superficie de la Hb desde una Cys-β93 a la otra en el lado simétricamente opuesto de la Hb es ∼110 Å, DG > RF, permitiendo así una conformación en hongo de los polímeros de PEG injertados en P5K2. Esto se refleja en las características del PEG de la estructura SAXS de P5K2, que muestra una forma elipsoidal general con Dmax = 115 Å. El cálculo del diámetro máximo para P5K2 utilizando la dimensión Flory para PEG de 5 kD da una molécula con Dmax ∼ 190 Å (es decir, diámetro de Hb = 70 Å + PEGs, 2 × 60 Å), proporcionando así una estimación para la conformación de hongo de las cadenas de PEG en P5K2 que se pliegan a ∼60% de sus dimensiones Flory completas.
La molécula de P5K6, más altamente coordinada con PEG, contiene los dos sitios de unión específicos (Cys-β93) y de cuatro a cinco sitios injertados de PEG adicionales. La estructura de la solución SAXS implica que las cadenas de PEG de P5K6 tienen una mayor interacción estérica para formar una forma aún más alargada en comparación con P5K2 (Fig. 4). Utilizando una aproximación en la que las cadenas de PEG se distribuyen uniformemente sobre la superficie de la Hb, la DG se reduce a ∼55 Å, y la DG ≈ RF, sugiriendo así una conformación de PEG más extendida pero todavía en una transición de seta a cepillo. Utilizando la dimensión Flory máxima en comparación con la Dmax = 130 Å medida, las cadenas de PEG de 5 kD en P5K6 parecen plegarse a ∼70% de su dimensión Flory completa, lo que es coherente con un aumento de la extensión del PEG en P5K6 en comparación con P5K2 por restricciones estéricas.
Por la determinación directa del tamaño de partícula por SAXS combinada con el análisis de Flory, hemos predicho que P5K6 se encuentra en una transición hongo-cepillo y, por tanto, no fue diseñada para alcanzar su tamaño máximo de partícula cuando los PEGs conjugados están completamente extendidos. Las nuevas moléculas de PEG-Hb pueden ser diseñadas para obtener partículas más grandes, de tal manera que la DG < RF ya sea por: 1), creando una Hb más altamente conjugada con más sitios de unión de PEG, disminuyendo así la DG, o 2), aumentando la longitud del PEG, aumentando así la RF. Duplicar el tamaño del PEG a 10 kD (es decir, P10Kx, donde x es el número de sitios de conjugación), aumenta la RF a ∼90 Å, lo que predecimos que proporcionaría una conformación de hongo en P10K2 pero se acercaría a una conformación de cepillo más completa en P10K6. Sin embargo, se desconoce cómo la ampliación de las longitudes del polímero PEG altera las interacciones estéricas durante la reacción de conjugación química PEG-Hb, por lo que los nuevos diseños justifican la práctica experimental con las relaciones de reacción junto con los estudios SAXS para verificar el punto de transición de seta a cepillo.