DISCUSIÓN

La amplificación del ácido nucleico mediante RT-PCR u otras técnicas proporciona un diagnóstico más preciso de la meningitis por EV que las técnicas disponibles anteriormente, como el cultivo viral. Con la disponibilidad de estas técnicas de diagnóstico sensibles, muchas muestras de LCR se envían ahora para el análisis de ácido nucleico de EV. Hemos monitorizado el perfil del LCR, incluyendo el recuento de leucocitos y el nivel de proteínas, para ayudar a evaluar el rendimiento de la RT-PCR de EV utilizada en nuestro laboratorio. Ahora hemos analizado los datos basados en los especímenes enviados para la RT-PCR de EV durante el período de 3 años de 2001 a 2003 para reevaluar la relación entre los parámetros del LCR y la presencia de infección por EV del sistema nervioso central (SNC). Durante uno de esos años, se produjo un gran brote de VNO en nuestra zona, lo que nos permitió evaluar el impacto de la presencia de otro patógeno neurotrópico en la relación entre las anomalías en el perfil del LCR y la posible presencia de EV RT-PCR. Nuestros hallazgos pueden ser útiles para los clínicos y los trabajadores de laboratorio que buscan optimizar su uso de las pruebas de ácido nucleico de EV.

El objetivo principal de nuestro estudio fue la relación entre los recuentos de leucocitos del LCR y los resultados de la RT-PCR de EV. Estábamos interesados en determinar la proporción de pacientes con infección del SNC por EV y un recuento elevado de leucocitos del LCR. También nos interesaba determinar la proporción de pacientes con recuentos elevados de leucocitos en LCR que se debían a la infección por EV. Nuestros datos muestran que ambas proporciones están fuertemente influenciadas por la edad. El hallazgo de la ausencia de pleocitosis en el LCR en las muestras de LCR que fueron positivas para el ARN de los EV se limitó en gran medida a los bebés menores de 2 meses y fue bastante común (28%) en este grupo de edad, lo que probablemente refleja la inmadurez inmunológica de estos pacientes. Resulta tentador especular con la posibilidad de que en estos pacientes aún no se haya desarrollado la respuesta de quimioquinas necesaria para el reclutamiento de leucocitos en el lugar de la infección. Entre los pacientes de mayor edad, menos del 2% de los que presentaban infección por EV en el SNC carecían de pleocitosis. Por el contrario, el hallazgo de pleocitosis en el LCR con una RT-PCR negativa de EV fue más común entre las muestras de los pacientes de más edad. No es sorprendente que este hallazgo también fuera más común durante la temporada en la que se produjo un brote considerable de la enfermedad del VNO en la zona atendida por nuestro laboratorio.

Estudios anteriores más pequeños también se han centrado en una comparación de los resultados de la RT-PCR de EV y los parámetros del LCR. Henquell et al. (5) informaron sobre 61 pacientes con síntomas de meningitis y compararon los resultados del cultivo y la PCR de EV con los hallazgos del LCR. Cincuenta y seis de los 61 pacientes (92%) fueron positivos a la PCR, pero 9 pacientes que tenían >1,5 años de edad tenían recuentos de células del LCR de <10 células/mm3 y eran positivos a la PCR o al cultivo. Por lo tanto, en su estudio, la correlación entre la pleocitosis y la positividad de la RT-PCR de EV no fue buena. Böttner et al. (2) informaron sobre una cohorte de 70 pacientes con síntomas de meningitis durante el verano de 2000. En ese estudio, 29 (46%) de 61 ensayos de RT-PCR de EV en LCR fueron positivos. Los recuentos de células del LCR oscilaban entre 2 y 1.820 células/mm3, con una media de 151. Los autores informaron de que no había diferencias en los resultados de laboratorio entre los pacientes de su estudio que dieron positivo en la RT-PCR de EV y los que fueron negativos, pero no proporcionaron recuentos celulares detallados del LCR. La explicación de las diferencias entre los resultados de esos estudios y el presente estudio no está clara, pero podría reflejar diferencias biológicas en las VE que se detectan o diferentes características de rendimiento de los ensayos de RT-PCR de VE.

Uno de los aspectos interesantes del presente estudio es centrar la atención en las causas de la pleocitosis del LCR en pacientes cuyo ensayo de RT-PCR de VE es negativo. Una posible explicación es que el ensayo puede no detectar todas las infecciones por EV. No conocemos la sensibilidad analítica (molecular) real del ensayo Chemicon en cuanto a su capacidad para detectar niveles bajos de ARN viral. Hemos investigado la sensibilidad y hemos descubierto que es del orden de 2,0 veces la dosis infecciosa del 50% del cultivo de tejidos, pero no sabemos cuántos genomas de VE representa esto, ni tampoco se sabe cuántas partículas no infecciosas se producen en una infección aguda en el LCR humano. Sin embargo, es poco probable que ésta sea la única explicación, ya que, en nuestro estudio, 21 de 148 pacientes (14%) que tenían ≤2 meses de edad y 169 de 549 pacientes (31%) que tenían >2 meses de edad presentaron pleocitosis y fueron negativos a la RT-PCR de EV. Se ha demostrado que los cebadores y la sonda utilizados en nuestro estudio detectan todos menos 6 de los 64 EVs conocidos que infectan a los humanos (13). Un EV, el coxsackievirus A15, no estaba disponible para las pruebas, y otros dos que no se detectaron con esta combinación de cebadores y sondas, los ecovirus 22 y 23, han sido reclasificados desde entonces como parechovirus (16). Los seis EVs que no se detectaron son epidemiológicamente raros. Otras infecciones, como el VHS, el VEB y el VNO, se diagnosticaron en algunos de los pacientes con pleocitosis, pero sólo representaron 18 infecciones o el 23% de todos los pacientes de este estudio con pleocitosis y una RT-PCR de EV negativa en el año 2002 (n = 77). Es posible que algunos de los pacientes restantes tuvieran infecciones por otros agentes infecciosos, como los parechovirus (16). Además, algunos de los casos observados de pleocitosis en este estudio pueden haberse debido a causas no infecciosas de pleocitosis, incluyendo reacciones a medicamentos como el cotrimoxazol, agentes antiinflamatorios no esteroideos e inmunoglobulina intravenosa. La infección bacteriana del tracto urinario también se ha implicado como causa de pleocitosis del LCR en niños (18).

Se consideró el uso de los niveles de proteínas del LCR como indicador de la positividad de la RT-PCR de EV. Sin embargo, los datos mostraron que el nivel de proteínas del LCR no era sensible ni específico cuando se utilizaba por sí mismo, ni tampoco aumentaba la sensibilidad o la especificidad cuando se utilizaba junto con la pleocitosis. Las curvas de características operativas del receptor mostraron que el nivel de proteínas del LCR por sí solo nunca tuvo una especificidad superior al 80% en ninguno de los niveles de corte investigados, y en ningún grupo de edad ni en ninguno de los tres niveles que investigamos la sensibilidad y la especificidad fueron superiores al 80%. La mejor correlación entre los niveles de proteína del LCR y la positividad de la RT-PCR de EV se produjo en los pacientes que tenían >2 meses de edad en el 80% del punto de corte normal, donde la sensibilidad fue del 68% y la especificidad del 78%.

La circulación del VN en la comunidad durante la temporada de EV de 2002 fue potencialmente un factor de confusión al utilizar los marcadores del LCR como correlación de la positividad de la RT-PCR de EV. De hecho, los datos de la prueba z de la Tabla33 confirman que había diferencias significativas entre los datos de las temporadas de 2001 y 2002 sobre las especificidades de la pleocitosis sola o la pleocitosis y/o el nivel elevado de proteínas como correlatos de la positividad de la RT-PCR de EV, quizás debido a la presencia del VNO en San Luis durante la temporada de 2002. En 2002, hubo 67 muestras de LCR de pacientes de >2 meses de edad que tenían pleocitosis que fueron negativas por la PCR de EV. De ellas, 10 (15%) fueron positivas para el VN y 18 (27%) fueron positivas para el VN u otro virus. Si se eliminan los 18 falsos positivos de los cálculos de 2002, la especificidad y el VPP aumentan del 56% y el 23%, respectivamente, al 63% y el 29%. La especificidad y el VPP para todas las muestras de pacientes que tenían >2 meses en 2001 fueron del 62% y el 66%, respectivamente. La eliminación de los falsos positivos atribuibles a la presencia de otros virus sigue sin explicar el descenso del VPP de 2001 a 2002. Deben intervenir otros factores desconocidos. Así pues, la presencia de otra causa (infecciosa o de otro tipo) de pleocitosis del LCR en la comunidad disminuye la capacidad del laboratorio para predecir la positividad de los EV basándose en los hallazgos del LCR.

Además de centrar la atención en las causas de pleocitosis del LCR distintas de la infección por EV, los resultados de este estudio tienen dos aplicaciones prácticas. La primera es que los laboratorios que realizan la RT-PCR de EV pueden utilizar la comparación de los resultados de la RT-PCR con los recuentos de células del LCR para desarrollar métricas que puedan utilizarse como parte de un programa de garantía de calidad para ese ensayo. Basándonos en nuestra experiencia, una métrica es que la RT-PCR de EV debe ser positiva en aproximadamente el 75% de los bebés menores de 2 meses de edad con pleocitosis de LCR, en aproximadamente el 65% de los bebés y niños de 2 meses a 18 años de edad con pleocitosis de LCR, y en aproximadamente el 25% de los pacientes mayores de 18 años de edad con pleocitosis de LCR. Estas cifras se obtienen utilizando los datos de las dos temporadas en las que el VNO estuvo ausente o fue poco frecuente. La circulación de arbovirus conocidos o nuevos u otros virus que pueden causar meningitis debe considerarse para el análisis de los datos relacionados con esta métrica, porque causará una disminución en la proporción de pacientes con pleocitosis que tienen un resultado positivo de RT-PCR de EV. Los laboratorios que no cumplan esta norma pueden beneficiarse de la investigación de la sensibilidad analítica de su ensayo, pero también deben estar atentos a la posible presencia de otros agentes que puedan causar pleocitosis en el LCR.

Una segunda métrica que puede utilizarse para el control de calidad es que el ensayo de RT-PCR de EV debe ser negativo en aproximadamente el 98% de los pacientes mayores de 2 meses de edad que carecen de pleocitosis en el LCR, y en aproximadamente el 70% de los pacientes menores de 2 meses de edad sin pleocitosis. La detección de ARN de EV en un porcentaje mayor de pacientes que carecen de pleocitosis debe hacer que los laboratorios consideren si puede haber contaminación por PCR. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que estos porcentajes probablemente variarán de una región a otra, de una población de pacientes a otra, de un ensayo de diagnóstico a otro y de una estación a otra, posiblemente dependiendo del EV que esté circulando.

La segunda aplicación práctica de los hallazgos del presente estudio es que los laboratorios pueden utilizar estos datos para establecer criterios que maximicen la eficiencia de las pruebas de RT-PCR de EV. Por ejemplo, dado que la ausencia de pleocitosis tiene un valor predictivo superior al 98% para un resultado negativo de la RT-PCR en pacientes de más de 2 meses de edad, los laboratorios pueden optar por establecer un punto de corte para las pruebas de RT-PCR de EV basado en la presencia o ausencia de pleocitosis. Utilizando los datos del presente estudio, la aplicación de este punto de corte habría dado lugar a la exclusión de 223 de 549 muestras (sobre la base de las 549 muestras de pacientes que tenían >2 meses de edad para los que se disponía de recuentos de células de LCR), con un fallo en la detección de sólo 3 muestras positivas (1,3%) que habrían estado en el grupo excluido de 223 muestras. Los tres pacientes con infección por EV pero sin pleocitosis tenían 5 meses, 10 años y 15 años. Se sospechaba que uno de estos pacientes (el de 10 años) tenía meningitis por EV debido a la rigidez del cuello, pero los otros dos tenían síntomas que estaban menos claramente asociados a la meningitis. El paciente de 10 años probablemente habría sido sometido a la prueba de detección de EV basándose en la sospecha clínica y no en la pleocitosis del LCR, pero los otros dos podrían no haber sido sometidos a la prueba. En los tres casos, el resultado positivo de la PCR para EV no tuvo un impacto significativo en el manejo del caso. Si se adopta una medida como la que hemos sugerido, recomendamos que se aplique a los pacientes de más de 2 meses de edad y que se garantice la existencia de un mecanismo que permita la realización de pruebas en casos individuales con una fuerte sospecha clínica de infección por EV, independientemente de la edad del paciente o de la presencia de pleocitosis en el LCR. Obviamente, un programa de cribado basado en la pleocitosis del LCR sólo es práctico para los laboratorios cuyo acceso a los datos de recuento de células del LCR sea lo suficientemente rápido como para que la aplicación del criterio de cribado no retrase la realización del ensayo. Estudios anteriores han demostrado claramente que los ensayos de EV deben realizarse de forma muy oportuna para que tengan un impacto en la toma de decisiones clínicas (14).