L’ADN recombinant (ou ADNr) est obtenu en combinant l’ADN de deux sources ou plus. Dans la pratique, le processus implique souvent la combinaison de l’ADN de différents organismes. Le processus dépend de la capacité à couper et à réunir les molécules d’ADN en des points identifiés par des séquences spécifiques de bases nucléotidiques appelées sites de restriction. Les fragments d’ADN sont coupés de leur position normale dans le chromosome à l’aide d’enzymes de restriction (également appelées endonucléases de restriction), puis insérés dans d’autres chromosomes ou molécules d’ADN à l’aide d’enzymes appelées ligases.

Clonage de gènes

Il décrit le processus de copie de fragments d’ADN qui peuvent ensuite être utilisés à de nombreuses fins différentes, comme la création de cultures génétiquement modifiées ou la recherche d’un remède contre une maladie. Il existe deux types de clonage de gènes : in vivo, qui implique l’utilisation d’enzymes de restriction et de ligases en utilisant des vecteurs et en clonant les fragments dans des cellules hôtes (comme on peut le voir dans l’image ci-dessus). L’autre type est in vitro qui consiste à utiliser la méthode de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour créer des copies de fragments d’ADN.

Pour le clonage in vivo, un fragment d’ADN, contenant un seul gène ou un certain nombre de gènes, est inséré dans un vecteur qui peut être amplifié dans une autre cellule hôte. Un vecteur est une section d’ADN qui peut incorporer un autre fragment d’ADN sans perdre la capacité d’auto-réplication, et un vecteur contenant un fragment d’ADN supplémentaire est connu comme un vecteur hybride. Si le fragment d’ADN comprend un ou plusieurs gènes, le processus est appelé clonage de gènes.

Clonage d’ADN dans des plasmides

Contributeur : Système d’information de gestion du génome, Laboratoire national d’Oak Ridge, États-Unis. Department of Energy Genome Programs http://genomics.energy.gov

Il existe 4 types de vecteurs différents :

• Vecteurs plasmidiques
• Vecteurs phagiques Lamda (λ)
• Cosmides
• Vecteurs d’expression

La cellule hôte copie l’ADN cloné en utilisant ses propres mécanismes de réplication. Divers types de cellules sont utilisés comme hôtes, notamment les bactéries, les cellules de levure et les cellules de mammifères.

Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Source : Andy Vierstraete

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

C’est une méthode in vitro permettant de réaliser de nombreuses copies d’une section spécifique d’ADN, sans avoir besoin de vecteurs ou de cellules hôtes. L’ADN à copier – l’ADN matrice – est mélangé avec des amorces avant et arrière complémentaires de l’extrémité de l’ADN matrice, des nucléotides et une version de l’ADN polymérase connue sous le nom de Taq polymérase. (Cette enzyme est stable à haute température et est obtenue à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus). Le processus implique la répétition de trois étapes :

• dénaturation, qui sépare les deux brins de nucléotides de la molécule d’ADN
• recuit des amorces, au cours duquel les amorces se lient à l’ADN simple brin
• extension, au cours de laquelle des nucléotides sont ajoutés aux amorces – dans le sens 5′ vers 3′ – pour former une copie double brin de l’ADN cible.

Chaque cycle prend quelques minutes, et des cycles répétés peuvent produire de grandes quantités d’une séquence d’ADN spécifique en quelques heures plutôt qu’en quelques jours. Cependant, cette méthode de clonage nécessite la connaissance de certains détails sur la séquence nucléotidique à copier, et la technique est très sensible à de petites quantités de contamination.

Libres de gènes

Source : http://www.emunix.emich.edu/~rwinning/genetics/index.htm

Une génothèque est une grande collection de séquences d’ADN clonées provenant d’un seul génome. Une génothèque, (comme on peut le voir ci-dessus) en théorie, contiendrait au moins une copie de chaque séquence du génome d’un organisme. Elles sont utilisées pour étudier la structure d’un chromosome donné, ou pour cloner des gènes spécifiques. Ces types de bibliothèques peuvent être préparés à partir d’un sous-ensemble du génome entier (par exemple, un seul chromosome). La première étape de la création d’une bibliothèque génomique consiste à fragmenter, ou « fractionner », le génome à l’aide de méthodes physiques ou d’enzymes de restriction. Les fragments sont ensuite liés à des vecteurs appropriés et clonés dans une population cellulaire hôte adéquate.

Une bibliothèque d’ADNc (ADN complémentaire) contient l’ADN présent dans une population cellulaire donnée qui est préparé à partir de l’ARNm (ARN messager) à l’aide de l’enzyme transcriptase inverse. L’ADNc résultant représente les gènes exprimés dans la population cellulaire en tant que sous-ensemble du génome entier, et peut être cloné à l’aide d’un vecteur et d’une cellule hôte appropriée (comme indiqué dans le schéma ci-dessus). L’ADNc ne comprendra pas d’introns ou de séquences régulatrices, car ceux-ci sont éliminés de l’ARN au cours du traitement, ce qui facilite la maintenance d’une bibliothèque d’ADNc. Une bibliothèque d’ADNc peut également être préparée en utilisant la PCR par transcriptase inverse (RT-PCR).

L’identification des produits géniques dans une bibliothèque de gènes

Les enzymes de restriction (pour couper l’ADN) et l’électrophorèse sur gel (pour séparer les fragments résultants) peuvent être utilisées pour produire une carte physique des segments d’ADN dans un processus connu sous le nom de cartographie de restriction. Un exemple de ce à quoi peut ressembler l’une d’entre elles peut être vu ci-dessous.

Source : Université de Leicester

Il existe également un certain nombre de techniques qui peuvent être utilisées pour identifier des gènes ou des produits génétiques spécifiques dans une bibliothèque de gènes et ce sont : Southern blotting, Northern blotting et Western blotting. Cependant, la technique expérimentale la plus puissante pour étudier la génétique au niveau moléculaire est le séquençage de l’ADN, qui permet de déterminer les séquences nucléotidiques des gènes, voire de chromosomes entiers. Les technologies de séquençage automatisé nous permettent aujourd’hui de séquencer l’ensemble des génomes d’organismes, des bactéries aux êtres humains.

Génétique moléculaire et biotechnologie

Les nouvelles techniques de génétique moléculaire, associées aux développements des biotechnologies associées, ont permis des avancées dans différents domaines. Nous pouvons désormais analyser le génome d’espèces qui apportent une contribution importante à l’agriculture, à la production de carburant ou au développement de médicaments. Nous pouvons déplacer des gènes spécifiques d’un organisme à un autre pour créer des plantes et des animaux transgéniques, et utiliser des techniques de clonage animal pour produire des animaux génétiquement identiques, comme le mouton Dolly, et plus récemment, des animaux de compagnie clonés comme les chats et les chiens.

Le processus de clonage est simple, mais les résultats ne sont pas toujours prévisibles. Il a fallu plusieurs centaines de tentatives pour qu’il fonctionne et produise un seul mouton vivant, et le clonage en lui-même soulève de nombreuses questions non seulement sur les avantages et les risques, mais aussi de nombreuses questions éthiques.

Diagramme de porcs pour montrer comment le clonage animal est réalisé. Source : National Human Genome Research Institute

La technique des empreintes génétiques, qui permet d’identifier les individus et les relations entre les individus a trouvé de nombreuses applications dans la science d’aujourd’hui. Des recherches sont également en cours sur la thérapie génique, qui examine la possibilité d’introduire des gènes clonés pour compenser des gènes défectueux ou mutants. Et d’autres domaines, par exemple, le clonage humain et la recherche sur les cellules souches, ouvrent de nombreuses questions éthiques qui doivent être abordées parallèlement aux développements scientifiques.

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