Depois de trabalhar no Hospital New England durante 15 anos, Mahoney foi aceite na sua escola de enfermagem em 1878, aos 33 anos de idade. O programa de 16 meses era muito rigoroso e consistia em dias de 16 horas. Quando os estudantes não estavam a trabalhar nas enfermarias do hospital ou a fazer serviço privado nas casas dos pacientes, esperava-se que frequentassem aulas e palestras ao longo do dia. Apenas quatro dos 42 alunos originais que iniciaram o programa tinham a resistência e a força de vontade para completar o curso. Quando recebeu o seu diploma em 1879, tornou-se a primeira enfermeira profissional negra americana e juntou-se às fileiras de enfermeiros famosos na história.

Mahoney dedicou-se à enfermagem privada durante a maior parte da sua carreira de 30 anos devido ao preconceito racial ainda prevalecente na enfermagem pública. Muitos dos seus pacientes eram de famílias de prestígio e ficaram impressionados com a sua habilidade e profissionalismo. No final da sua carreira, foi directora de um orfanato negro em Nova Iorque. Dedicou-se ao seu trabalho e nunca casou.

Em 1896, Mahoney juntou-se aos recém-formados e principalmente brancos Antigos Alunos Associados de Enfermeiras dos Estados Unidos e Canadá, mais tarde conhecidos como Associação Americana de Enfermeiras (ANA). Devido à sua lentidão em aceitar membros negros, ajudou a formar a National Association of Colored Graduate Nurses (NACGN) e falou na sua primeira convenção em 1909. Nessa altura, ela abordou as desigualdades dos afro-americanos na educação em enfermagem e pediu uma manifestação no Hospital New England. A convenção apoiou-a de todo o coração, elegeu o seu capelão e deu-lhe um estatuto de membro vitalício. Durante muitos anos, ela trabalhou para recrutar enfermeiros minoritários para se juntarem à organização. Em grande parte devido aos seus esforços, o número de enfermeiras afro-americanas duplicou de 1910 para 1930.