Gardner was in de zomer van 1940 op bezoek bij haar zus Beatrice in New York City, toen Beatrice’s echtgenoot Larry Tarr, een beroepsfotograaf, aanbood haar te portretteren als cadeau voor haar moeder Molly. Hij was zo tevreden met het resultaat dat hij het eindproduct in de etalage van zijn Tarr Photography Studio op Fifth Avenue plaatste.
Een juridisch medewerker van Loews Theatres, Barnard Duhan, zag Gardner’s portret in Tarr’s studio. Duhan deed zich in die tijd vaak voor als een talent scout van Metro-Goldwyn-Mayer (MGM) om meisjes te ontmoeten, gebruikmakend van het feit dat MGM een dochteronderneming van Loews was. Duhan ging Tarr’s studio binnen en probeerde Gardner’s nummer te krijgen, maar werd afgewezen door de receptioniste. Duhan maakte de opmerking: “Iemand moet haar info naar MGM sturen”, en de Tarrs deden dat onmiddellijk. Kort daarna reisde Gardner, die op dat moment student was aan het Atlantic Christian College, naar New York om op het kantoor van MGM in New York geïnterviewd te worden door Al Altman, hoofd van MGM’s New Yorkse talentenafdeling. Terwijl de camera’s draaiden, dirigeerde hij de 18-jarige om naar de camera toe te lopen, zich om te draaien en weg te lopen, en vervolgens wat bloemen in een vaas te herschikken. Hij probeerde niet haar stem op te nemen omdat haar sterke zuidelijke accent het moeilijk voor hem maakte haar te verstaan. Louis B. Mayer, hoofd van MGM, stuurde echter een telegram naar Altman: “Ze kan niet zingen, ze kan niet acteren, ze kan niet praten, ze is geweldig!” Ze kreeg een standaardcontract aangeboden door de studio en vertrok in 1941 van school naar Hollywood, met haar zus Beatrice als begeleidster. MGM’s eerste opdracht was om haar een spraakcoach te geven, want haar Carolina-dreun was bijna onbegrijpelijk voor hen, en Harriet Lee als haar zanglerares.
Haar eerste optreden in een speelfilm was als figurant in het Norma Shearer-vehikel We Were Dancing (1942). Vijftien bijrollen later kreeg ze haar eerste rol op het witte doek in 3 Men in White (1944), een Dr. Kildare-film waarin ze haar moeder naar het ziekenhuis brengt voor behandeling. Na vijf jaar van bijrollen, meestal bij MGM en veel daarvan zonder vermelding, werd Gardner bekend in de Mark Hellinger productie The Killers (1946), waarin ze de femme fatale Kitty Collins speelde.
Andere opmerkelijke films zijn The Hucksters (1947), Show Boat (1951), The Snows of Kilimanjaro (1952), Lone Star (1952), Mogambo (1953), The Barefoot Contessa (1954), Bhowani Junction (1956), The Sun Also Rises (1957) en On the Beach (1959). Off-camera kon ze geestig en kernachtig zijn, zoals in haar beoordeling van regisseur John Ford, die Mogambo regisseerde (“De gemeenste man op aarde. Volkomen slecht. Aanbad hem!”). In The Barefoot Contessa speelde ze de rol van de tot mislukken gedoemde schoonheid Maria Vargas, een hevig onafhankelijke vrouw die met de hulp van een Hollywoodregisseur, gespeeld door Humphrey Bogart, van Spaanse danseres tot internationale filmster evolueert, met tragische gevolgen. Gardner’s beslissing om de rol te accepteren werd beïnvloed door haar eigen levenslange gewoonte om op blote voeten te lopen. Gardner speelde vervolgens de rol van Guinevere in Knights of the Round Table (1953), tegenover acteur Robert Taylor als Sir Lancelot. In haar films van de jaren 1950 vertolkte ze een hertogin, een barones en andere dames van adellijke afkomst, een bewijs van haar verfijning.
In 1960 vertolkte ze de rol van Soledad in The Angel Wore Red. Ze speelde tussen Charlton Heston en David Niven in 55 Days at Peking (1963), dat zich afspeelde in China tijdens de Bokseropstand in 1900. Het jaar daarop speelde ze haar laatste grote hoofdrol in het veelgeprezen The Night of the Iguana (1964), gebaseerd op een toneelstuk van Tennessee Williams, met in de hoofdrollen Richard Burton als een atheïstische geestelijke en Deborah Kerr als een zachtaardige kunstenares die met haar bejaarde dichterlijke grootvader meereist. John Huston regisseerde de film in Puerto Vallarta, Mexico, en stond erop de film in zwart-wit te maken – een beslissing waar hij later spijt van kreeg vanwege de levendige kleuren van de flora. Gardner kreeg een plaats onder Burton, maar boven Kerr. Ze werd genomineerd voor een Golden Globe Award voor Beste Actrice in een Dramafilm en een BAFTA Award voor Beste Actrice in een Hoofdrol.
Ze verscheen daarna weer met Burt Lancaster, haar tegenspeler uit The Killers, ditmaal samen met Kirk Douglas en Fredric March, in Seven Days in May (1964), een thriller over een poging tot militaire overname van de Amerikaanse regering. Gardner speelde een voormalige love interest van Lancaster die Douglas had kunnen helpen bij het voorkomen van een coup tegen de president van de Verenigde Staten.
John Huston koos Gardner voor de rol van Sarah, de vrouw van Abraham (gespeeld door George C. Scott), in de Dino De Laurentiis-film The Bible: In the Beginning…, die werd uitgebracht in 1966. In een interview uit 1964 vertelde ze waarom ze de rol accepteerde:
Hij had meer vertrouwen in mij dan ikzelf. Nu ben ik blij dat ik geluisterd heb, want het is een uitdagende rol en een zeer veeleisende. Ik begin als jonge vrouw en doorloop verschillende periodes, waardoor ik me psychologisch aan elke leeftijd moet aanpassen. Het is een complete verandering voor mij, en zeer intrigerend. In deze rol moet ik een personage creëren, niet alleen er een spelen.
Twee jaar later, in 1966, zocht Gardner kort naar de rol van Mrs. Robinson in Mike Nichols’ The Graduate (1967). Naar verluidt belde ze Nichols op en zei: “Ik wil je zien! Ik wil praten over dat Graduate-gedoe!” Nichols heeft haar nooit serieus overwogen voor de rol, hij gaf de voorkeur aan een jongere vrouw (Anne Bancroft was 35, Gardner 44), maar hij bezocht wel haar hotel, waar hij later over vertelde: “Ze zat aan een klein Frans bureautje met een telefoon, ze nam elk filmster cliché door. Ze zei: ‘Oké, laten we het over je film hebben. Allereerst strip ik voor niemand.”
Gardner verhuisde in 1968 naar Londen en onderging een electieve hysterectomie om haar zorgen weg te nemen dat ze baarmoederkanker zou krijgen, wat haar moeder het leven had gekost. Dat jaar verscheen ze in Mayerling, waarin ze de bijrol speelde van de Oostenrijkse keizerin Elisabeth van Oostenrijk, tegenover James Mason als keizer Franz Joseph I.
Ze verscheen in een aantal rampenfilms in de jaren 1970, met name Earthquake (1974) met Heston, The Cassandra Crossing (1976) met Lancaster, en de Canadese film City on Fire (1979). Ze verscheen kort als Lillie Langtry aan het einde van The Life and Times of Judge Roy Bean (1972), en in The Blue Bird (1976). Haar laatste film was Regina Roma (1982). In de jaren tachtig acteerde ze voornamelijk op televisie, waaronder de miniserie-remake van The Long, Hot Summer en in een story arc in Knots Landing (beide 1985).