Typowanie DNA: Minisatellites and Short Tandem Repeats

Typowanie DNA ma wyraźne zalety w porównaniu z tradycyjną analizą białek, głównie dlatego, że jest bardziej informacyjne i może być analizowane w drobnym lub zdegradowanym materiale, ponieważ DNA jest fizycznie znacznie bardziej odporne na degradację niż białka. Ponadto, ten sam genotyp DNA może być uzyskany z dowolnej tkanki (tj, krew, ślina, nasienie, włosy, skóra i kości), podczas gdy analiza markerów białkowych jest ograniczona do komórek, w których białka te ulegają ekspresji.

Minisatelity były początkowo wykrywane poprzez hybrydyzację sond do Southern blot genomowego DNA trawionego enzymami restrykcyjnymi, a wspólne „sekwencje rdzeniowe” pomiędzy różnymi loci minisatelitarnymi pozwoliły na zastosowanie sond do jednoczesnego wykrywania wielu niezależnych minisatelitów, dając hiper-zmienne wielopasmowe wzory znane jako odciski palców DNA.

Początkowo, sondy wieloogniskowe zostały zaproponowane do kryminalistycznej analizy genetycznej. Jednak tego typu sondy nie odniosły sukcesu na polu kryminalistycznym, gdyż mimo wysokiej informatywności, pojawiły się problemy statystyczne w ocenie materiału dowodowego w przypadku dopasowania pasm i standaryzacji. Z tych powodów, sondy wieloogniskowe zostały zastąpione w medycynie sądowej przez użycie specyficznych sklonowanych minisatelitów, „single locus probes” (SLPs), z których każda ujawniała tylko pojedynczy, wysoce polimorficzny, polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych, upraszczając w ten sposób interpretację. Zazwyczaj cztery SLP były używane kolejno do sondowania Southern blot, dając osiem hiperzmiennych fragmentów na osobnika.

To właśnie przy użyciu SLP przeprowadzono pierwsze śledztwo kryminalne oparte na DNA; sprawa ta zakończyła się skazaniem Colina Pitchforka za podwójny gwałt i zabójstwo w Leicestershire w 1986 roku. Bardzo szybko analiza DNA stała się standardową metodą w genetyce sądowej, ponieważ była wykorzystywana przez większość laboratoriów w pełnym zakresie zastosowań, zwłaszcza w kryminalistycznych sprawach sądowych (analiza plam i włosów) i identyfikacji.

Do czasu wprowadzenia analizy krótkich powtórzeń tandemowych (STR) poprzez amplifikację w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), analiza minisatelitów za pomocą SLP była bardzo popularna w laboratoriach kryminalistycznych.

Główną zaletą analizy SLP jest ogromna zmienność niektórych loci minisatelitarnych oraz dobrze udokumentowana wiedza na temat częstości mutacji w niektórych z nich. Główną wadą jest czas potrzebny na przeprowadzenie analizy oraz konieczność posiadania stosunkowo dużej ilości niezdegradowanego DNA, niezbędnego do skutecznego typowania SLP. Ponieważ DNA ekstrahowane z próbek kryminalistycznych jest często degradowane przez warunki środowiskowe, techniki SLP często nie dawały wiarygodnych wyników. Metoda PCR przezwyciężyła te trudności i znacznie zwiększyła przydatność technik profilowania DNA w kryminalistyce.

Metoda PCR została opracowana i nazwana przez Mullisa i współpracowników z Cetus Corporation w 1987 roku, chociaż jej zasada została szczegółowo opisana przez Khoranę i in. ponad dekadę wcześniej; jednakże zastosowanie PCR było ograniczone do czasu, gdy dostępne stały się odpowiednie termostabilne polimerazy DNA pochodzące z bakterii termofilnych.

Większość systemów typowania DNA opartych na PCR pozwala na identyfikację alleli jako odrębnych jednostek, ułatwiając w ten sposób standaryzację poprzez uniknięcie większości problemów statystycznych, które pojawiają się przy dopasowywaniu i łączeniu pasm SLP zajmujących kontinuum. Dodatkowo, poza zwiększoną czułością właściwą każdej technice PCR, ma ona większe szanse powodzenia w analizie starego lub bardzo zdegradowanego materiału, głównie ze względu na mniejsze rozmiary wielu polimorfizmów DNA (SNP i STR), co czyni je bardziej podatnymi na analizę metodą PCR.

Pierwszą grupą markerów stosowanych po amplifikacji PCR były geny HLA klasy II, w szczególności układ HLA DQA1 analizowany przy użyciu specyficznych sekwencyjnie sond oligonukleotydowych. Niemal natychmiast po wykazaniu, że analiza markerów DNA za pomocą techniki PCR jest możliwa, pojawiły się komercyjnie dostępne zestawy dla kilku loci genetycznych. Zestaw AmpliType PolyMarker PCR amplification kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) był bardzo popularny w laboratoriach kryminalistycznych w tamtym czasie. Za pomocą tego zestawu, loci HLA DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 i GC są amplifikowane w sposób multipleksowy. Ostatnie pięć wymienionych loci było typowanych jednocześnie w pojedynczym odwróconym pasku dot-blot zawierającym sondy ASO; HLA DQA1 był typowany w oddzielnym pasku.

Wysiłki naukowców sądowych zostały następnie skierowane na amplifikację polimorfizmów długości fragmentów. Minisatelita D1S80 (pMCT118) był pierwszym, który został zastosowany w analizie sądowej, ale wszystkie te wczesne systemy PCR zostały wyparte przez STRs (alternatywnie określane jako mikrosatelity). Analiza STR za pomocą PCR jest obecnie metodą z wyboru dla identyfikacji kryminalistycznej opartej na DNA.

STRs zostały odkryte w 1989 roku i zostały zastosowane w sprawach sądowych na początku lat 90-tych. Zalety stosowania STR-ów z powtórzeniami tetra- i pentanukleotydowymi (4- i 5-bazowe jednostki powtórzeń) w porównaniu z di- i trinukleotydami (2- i 3-bazowe powtórzenia) szybko stały się oczywiste i rozpoczęto systematyczne poszukiwania najbardziej dogodnych STR-ów. Następnie rozpoczął się proces standaryzacji technik i nomenklatury, realizowany przez takie instytucje jak SWGDAM w Stanach Zjednoczonych i EDNAP w Europie, przy aktywnej roli Komisji DNA ISFG.

Kolejnym ważnym krokiem była możliwość amplifikacji wielu loci STR w pojedynczej reakcji PCR typu multiplex. Kiedy ta metoda PCR została połączona z bezpośrednią detekcją amplifikowanych produktów w żelach poliakrylamidowych, profilowanie STR DNA stało się możliwe do zautomatyzowania. Komercyjne multipleksy STR dla manualnych systemów elektroforetycznych były dostępne od 1993 roku. Denaturujące żele poliakrylamidowe były używane do rozdzielania fragmentów DNA do czasu wprowadzenia elektroforezy kapilarnej, która wraz z wprowadzeniem technologii primerów znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi i zastosowaniem sekwenatorów DNA zrewolucjonizowała tę dziedzinę, umożliwiając typowanie dużych multipleksów STR. Od tego czasu dostępnych jest kilka komercyjnych multipleksów znakowanych barwnikiem, z których wszystkie zawierają szereg STR oraz amelogeninę do oznaczania płci. Obecnie stosowane multipleksy łączą 15 lub więcej STR. Łączna moc dyskryminacyjna STR jest bardzo wysoka, a prawdopodobieństwo przypadkowego dopasowania się dwóch niespokrewnionych osób (prawdopodobieństwo przypadkowego dopasowania – RMP) jest niższe niż 10-15 dla większości większych multipleksów STR.

Od połowy lat 90-tych komputerowe bazy danych zawierające profile STR z próbek z miejsca przestępstwa, skazanych przestępców, a w niektórych przypadkach osób aresztowanych, ale następnie oczyszczonych z zarzutów popełnienia przestępstwa, zapewniły organom ścigania możliwość powiązania przestępców z profilami STR z miejsca przestępstwa. Zastosowanie tej technologii umożliwiło rozwiązanie tysięcy przestępstw na całym świecie.

Wreszcie, przeprojektowanie starterów PCR, które były bliższe regionowi powtórzenia STR, umożliwiło w 2001 r. stworzenie „miniSTR” z potencjałem poprawy analizy zdegradowanego materiału biologicznego.