RESULTS AND DISCUSSION

Aby sklonować gen miostatyny z innych gatunków, skonstruowano biblioteki cDNA z RNA wyizolowanego z tkanki mięśni szkieletowych i przebadano je sondą mysiej miostatyny odpowiadającą konserwowanemu regionowi C-końcowemu, który jest dojrzałą, aktywną częścią cząsteczki. Na rycinie 1 przedstawiono wyrównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych miostatyny myszy, szczura, człowieka, pawiana, bydła, świni, owcy, kurczaka, indyka i zebrafish, wydedukowanych na podstawie analizy sekwencji nukleotydów klonów cDNA o pełnej długości. Wszystkie te sekwencje zawierają przypuszczalną sekwencję sygnałową dla wydzielania i przypuszczalne miejsce proteolitycznego przetwarzania RXXR (aminokwasy 263-266), po której następuje region zawierający konserwowane C-końcowe reszty cysteinowe, występujące u wszystkich członków rodziny transformującego czynnika wzrostu β (1). Jak widać z tego dopasowania, miostatyna jest wysoce konserwatywna u różnych gatunków. W rzeczywistości, sekwencje miostatyny mureny, szczura, człowieka, świni, kurczaka i indyka są w 100% identyczne w regionie C-końcowym, po przypuszczalnym miejscu proteolitycznego przetwarzania, a miostatyna pawiana, bydła i owiec zawiera tylko jedną do trzech różnic aminokwasowych w dojrzałym białku. Miostatyna Zebrafish jest znacznie bardziej zróżnicowana i w tym regionie jest tylko w 88% identyczna z pozostałymi.

Wysoki stopień zachowania sekwencji miostatyny u różnych gatunków sugeruje, że funkcja miostatyny również została zachowana. Aby ustalić, czy miostatyna odgrywa rolę w regulacji masy mięśniowej u zwierząt innych niż myszy, zbadaliśmy możliwość, że mutacje w genie miostatyny mogą odpowiadać za zwiększoną masę mięśniową obserwowaną u ras zwierząt gospodarskich o podwójnym umięśnieniu. Podwójne umięśnienie, które obserwowano u wielu ras bydła przez ostatnie 190 lat, wydaje się być dziedziczone jako pojedyncze główne locus autosomalne z kilkoma modyfikatorami ekspresji fenotypowej, co skutkuje niepełną penetracją (7). W najszerzej badanej rasie bydła o podwójnym umięśnieniu, Belgian Blue, fenotyp podwójnego umięśnienia (ryc. 2) segreguje się jako pojedyncze locus genetyczne oznaczone jako hipertrofia mięśniowa (mh) (8). Mutacja mh, która jest częściowo recesywna, powoduje średni wzrost masy mięśniowej o 20-25%, spadek masy większości innych narządów (9, 10) oraz zmniejszenie ilości tłuszczu śródmięśniowego i tkanki łącznej (11). Locus mh jest ściśle związany z markerami na regionie chromosomu 2 bydła (12), który jest synteniczny z regionem ludzkiego chromosomu 2 (2q32) (13), do którego zmapowaliśmy ludzki gen miostatyny za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (dane nie pokazane).

Podobieństwa w fenotypie między myszami null miostatyny i rasą bydła Belgian Blue oraz podobne pozycje na mapie genu miostatyny i locus mh sugerowały bydlęcego homologa miostatyny jako gen kandydujący dla locus mh. Aby określić, czy gen miostatyny bydlęcej jest zmutowany w rasie Belgian Blue, wszystkie trzy eksony tego genu pochodzące od pełnokrwistego buhaja Belgian Blue, pokazanego na rycinie 2, zostały amplifikowane metodą PCR, subklonowane i sekwencjonowane. Sekwencja kodująca miostatyny rasy Belgian Blue była identyczna z sekwencją holsztyńską z wyjątkiem delecji nukleotydów 937-947 w trzecim eksonie (Ryc. 3). Ta 11-nukleotydowa delecja powoduje przesunięcie ramki, które zgodnie z przewidywaniami prowadzi do powstania obciętego białka, które kończy się 14 kodonów poniżej miejsca mutacji. Oczekuje się, że delecja będzie mutacją zerową, ponieważ występuje tylko po pierwszych 7 aminokwasach regionu C-końcowego, powodując utratę 102 aminokwasów (aminokwasy 274-375). Ta mutacja jest podobna do celowanej mutacji u myszy null miostatyny, w której cały region kodujący dojrzałe białko został usunięty (2). W analizie Southern blot, przy użyciu oligonukleotydów odpowiadających sekwencji typu dzikiego lub zmutowanej, mutacja ta została znaleziona w obu allelach u 14/14 przebadanych sztuk pełnokrwistego bydła rasy belgijskiej niebieskiej (dane nie pokazane).

Sekwencjonowaliśmy również gen miostatyny u innej rasy bydła, Piemontese, u której podwójne umięśnienie występuje z wyjątkowo wysoką częstotliwością (4). Sekwencja piemoncka zawierała 2 zmiany nukleotydowe w stosunku do sekwencji holsztyńskiej. Jedną z nich była transwersja C do A w eksonie 1, skutkująca konserwatywnym zastąpieniem leucyny przez fenyloalaninę (aminokwas 94). Drugą była przemiana G na A w eksonie 3, skutkująca substytucją cysteiny na tyrozynę w dojrzałym regionie białka (aminokwas 313) (ryc. 3). Analiza Southern blot wykazała, że mutacja ta występowała w obu allelach u 10/10 badanych sztuk bydła rasy piemonckiej o podwójnym umięśnieniu. Mutacja ta prawdopodobnie skutkuje całkowitą lub prawie całkowitą utratą funkcji, ponieważ ta reszta cysteinowa jest niezmienna nie tylko wśród wszystkich sekwencji miostatyny, ale także wśród wszystkich znanych członków nadrodziny transformującego czynnika wzrostu β (1). Wiadomo, że ta reszta cysteinowa jest jednym z aminokwasów zaangażowanych w tworzenie wewnątrzcząsteczkowej struktury węzła cystynowego u członków tej nadrodziny, dla których znana jest struktura trójwymiarowa (14-17). Ponadto, gdy odpowiadająca cysteina w aktywinie A (cysteina-44) została zmutowana na alaninę, zmutowane białko miało tylko 2% dzikiego wiązania receptora i aktywności biologicznej (18).

Podobne pozycje na mapie genu miostatyny i locus mh oraz identyfikacja stosunkowo poważnych mutacji w genie miostatyny dwóch różnych ras bydła o podwójnej muskulaturze sugerują, że mutacje te są odpowiedzialne za fenotyp podwójnej muskulatury. Aby dodatkowo wesprzeć tę hipotezę, przeanalizowaliśmy DNA wyizolowane od 120 osobników bydła pełnej krwi lub czystej krwi 16 innych ras, które nie są klasyfikowane jako podwójnie umięśnione (11 Angus, 11 Charolais, 10 Holstein, 10 Brown Swiss, 10 Polled Hereford, 10 Gelbvieh, 9 Simmental, 9 Jersey, 9 Guernsey, 9 Ayrshire, 7 Limousin, 4 Brahman, 4 Polled Shorthorn, 4 Red Angus, 2 Chianina i 1 Texas Longhorn) pod kątem obecności każdej z tych mutacji (Rys. 4). Analiza Southern blot wykazała, że substytucja cysteiny na tyrozynę obecna w rasie Piemontese nie została wykryta u żadnego ze 120 osobników. Delecja 11 nukleotydów występująca u rasy Belgian Blue została wykryta w jednym allelu u jednego buhaja pełnej krwi rasy Red Angus bez podwójnego umięśnienia. W związku z tym zasugerowano, że fenotyp podwójnego umięśnienia, który jest sporadycznie obserwowany u wielu ras, może być spowodowany pojedynczą mutacją lub bardzo niewielką liczbą mutacji, które przeszły do wielu europejskich ras bydła podczas rozwoju współczesnych ras (7). Nasze wyniki pokazują, że mutacje miostatyny, które powodują podwójne umięśnienie, wystąpiły u bydła co najmniej dwukrotnie.

Wreszcie, aby wykluczyć obecność innych mutacji miostatyny w rasach innych niż podwójnie umięśnione, określiliśmy pełną sekwencję regionu kodującego miostatyny u 11 z tych ras (Angus, Charolais, Brown Swiss, Polled Hereford, Gelbvieh, Guernsey, Ayrshire, Limousin, Brahman, Polled Shorthorn i Texas Longhorn). Analiza ta ujawniła tylko polimorfizmy, które były albo cichymi zmianami w sekwencjach kodujących, albo były obecne w intronach i regionach nieulegających translacji.

Nieco inaczej niż u myszy, mutacja null miostatyny u bydła powoduje zmniejszenie rozmiarów narządów wewnętrznych i tylko niewielki wzrost masy mięśniowej (20-25% u rasy Belgian Blue w porównaniu z 200-300% u myszy z niedoborem miostatyny). Możliwe jest, że bydło po pokoleniach selektywnej hodowli dla dużej masy mięśniowej może być bliżej maksymalnej granicy wielkości mięśni, w przeciwieństwie do myszy, które nie były poddawane podobnej selekcji. W związku z tym, nawet u ras bydła, które nie są silnie umięśnione, sekwencja miostatyny zawiera dwie sąsiadujące niekonserwatywne różnice aminokwasowe (EG vs. KE) w regionie C-końcowym, w porównaniu z wszystkimi innymi badanymi gatunkami. Chociaż znaczenie funkcjonalne tych różnic jest nieznane, możliwe jest, że te dwie zmiany reprezentują częściowy allel utraty funkcji, który utrwalił się w populacji podczas wielu lat hodowli bydła.

Dla zastosowań rolniczych istnieją pewne wady podwójnie umięśnionego bydła, a mianowicie zmniejszenie płodności samic, niższa żywotność potomstwa i opóźnienie dojrzewania płciowego (19). Jednakże, w rasie Belgian Blue, zwiększona masa mięśniowa i zwiększona wydajność paszy w dużym stopniu równoważą te wady (20). Fakt, że mutacja null w genie miostatyny u bydła skutkuje zwierzętami, które są nadal żywotne i płodne oraz produkują wysokiej jakości mięso, wskazuje na potencjalną wartość wytwarzania wzrostu masy mięśniowej u innych zwierząt mięsnych, takich jak owce, świnie, kurczaki, indyki i ryby poprzez zakłócanie funkcji miostatyny. Rzeczywiście, wysoki stopień zachowania sekwencji u zwierząt od ssaków do ptaków i ryb sugeruje, że biologiczna funkcja miostatyny została zachowana w całym królestwie zwierząt.