Komórkowe DNA jest stale utleniane przez różne czynniki endogenne i egzogenne, a wynikające z tego uszkodzenia DNA mogą zwiększać ryzyko rozwoju raka i innych chorób. Guanina ma najniższy potencjał redoks spośród czterech zasad DNA i dlatego jest najłatwiej utleniana.

Podczas replikacji DNA, przyłączenie adeniny naprzeciwko produktu utleniania guaniny wywołuje transwersję G:C-T:A, podczas gdy przyłączenie guaniny naprzeciwko produktu utleniania guaniny wywołuje transwersję G:C-C:G. Mutacje te (patrz odnośniki w ) występują w wielu ważnych genach, a w szczególności w miejscach CpG w genie supresorowym guza p53 oraz w kodonach 12 i 13 onkogenu K-ras . Dlatego ważne jest przeanalizowanie wbudowywania nukleotydów i wydłużania DNA dla każdego produktu utleniania guaniny, aby wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw powstawania transwersji G:C-T:A i G:C-C:G.

8-Oxo-7,8-dihydroguanina (8-oxoG) (Rys. 1) jest jedną z najczęstszych oksydacyjnych zmian DNA i powstaje w różnych warunkach utleniania. 8-OxoG jest szeroko badany, ma znaczący wpływ biologiczny i jest wszechobecnym markerem oksydacyjnie uszkodzonego DNA. Analizy strukturalne ujawniły, że 8-oxoG przyjmuje konformację anty- lub syn: 8-oxoG w konformacji anty- tworzy pary zasad Watsona-Cricka z cytozyną, podczas gdy zmiana w konformacji syn wykorzystuje krawędź Hoogsteena zmiany do utworzenia pary zasad z adeniną (Rys. 2). Ponadto, polimerazy DNA włączają adeninę oprócz cytozyny naprzeciwko 8-oxoG , a 8-oxoG indukuje transwersję G:C-T:A w Escherichia coli (E. coli) i komórkach ssaków .

Ale chociaż 8-oxoG powoduje transwersje G:C-T:A, mechanizm leżący u podstaw generowania transwersji G:C-C:G nie może być wyjaśniony przez 8-oxoG. Ponadto, 8-oksoG jest łatwiej utleniana niż guanina z powodu niższego potencjału oksydacyjnego, a zatem różne zmiany oksydacyjne powstają w wyniku utleniania 8-oksoG. Dlatego konieczne jest zbadanie zarówno 8-oxoG jak i innych utlenionych zmian guaniny, aby zrozumieć różne zjawiska spowodowane utlenianiem guaniny.

Produkty utleniania guaniny powodujące transwersje G:C-C:G tworzą pary zasad poprzez wiązanie wodorowe z guaniną

Jak wcześniej wspomniano, transwersja G:C-C:G jest spowodowana przyłączeniem guaniny naprzeciwko produktu utleniania guaniny. W tym rozdziale najpierw opiszemy „zasadę A”. Adenina jest najczęściej przyłączaną zasadą przez polimerazy DNA, co sugeruje, że spośród czterech naturalnych zasad, adenina tworzy najwięcej oddziaływań hydrofobowych i wykazuje najlepszą zgodność przestrzenną z miejscem abazowym. Wbudowanie adeniny może niekoniecznie wymagać tworzenia wiązań wodorowych z różnymi uszkodzonymi miejscami DNA w szablonowym DNA. Natomiast preferencyjna insercja guaniny, oprócz oddziaływań hydrofobowych i zgodności przestrzennej, wymaga tworzenia wiązań wodorowych z zasadą szablonową. Dlatego też, w celu ujawnienia zmian powodujących transwersje G:C-C:G, ważne jest zbadanie produktów utleniania guaniny, które tworzą pary zasad poprzez wiązanie wodorowe z guaniną.

Potencjalne produkty utleniania guaniny powodujące transwersje G:C-C:G

Iz ulega powolnej hydrolizie do 2,2,4-triamino-5(2H)-oksazolonu (Oz) (Rys. 1) w obojętnym roztworze wodnym, a jego okres półtrwania w warunkach fizjologicznych wynosi 147 min . Ponadto, w wątrobowym DNA wykrywa się 2-6 cząsteczek Oz na 107 zasad guaninowych, a ostatnio wykazano, że ilość Oz znacznie wzrasta w obecności 5-metylocytozyny. Tak więc biologiczny wpływ Oza w replikacji DNA jest prawdopodobnie większy niż Iz.

Fragment Klenowa egzo-integruje adeninę naprzeciwko Oz in vitro, a Oz powoduje transwersje G:C-T:A w E. coli. W przeciwieństwie do tego, w naszym systemie reakcji in vitro, fragment exo- Klenowa włącza adeninę lub guaninę naprzeciwko Oz . Ponadto wykazaliśmy, że polimerazy DNA α, β, δ i ε wbudowują tylko guaninę przeciwną do Oz; polimerazy DNA γ, κ i polimeraza DNA Sulfolobus solfataricus IV, oprócz fragmentu exo- Klenowa, wbudowują guaninę i adeninę; polimeraza DNA η wbudowuje guaninę, adeninę i cytozynę; polimerazy DNA ζ i ι wbudowują guaninę, adeninę, cytozynę i tyminę; a REV1 wbudowuje cytozynę. Analizy te wskazują, że polimerazy DNA, z wyjątkiem REV1, wbudowują guaninę naprzeciwko Oz . Przewidzieliśmy, że Oz może tworzyć stabilną parę zasad z guaniną i że ta para zasad Oz:G ma dwa wiązania wodorowe i jest planarna (Rys. 3c). Niedawno przeprowadziliśmy eksperymenty denaturacji termicznej i stwierdziliśmy, że para zasad Oz:G jest bardziej stabilna termodynamicznie niż Oz:A, Oz:C i Oz:T .

Dodatkowo, polimerazy DNA α, β, γ, δ, ε, η, κ i ζ wydłużają primer do pełnej długości przez Oz . Tak więc, Oz wydaje się być utlenioną zmianą związaną z indukcją transwersji G:C-C:G. W szczególności, polimeraza DNA ζ wydłuża się poza Oz z prawie taką samą wydajnością jak poza G, ale nie poza tetrahydrofuran (THF; chemicznie stabilny analog miejsca abazowego), 8-oxoG lub O 6-metyloguaninę. Dane te wskazują, że polimeraza DNA ζ jest efektywną, podatną na błędy polimerazą replikacyjną dla Oz. Ponadto, tylko REV1 wbudowuje cytozynę naprzeciwko Oz, a częstotliwość wstawiania cytozyny jest zgodna z kolejnością Oz > guanidinohydantoina (Gh) > THF > 8-oxoG . Biorąc pod uwagę, że REV1 może oddziaływać z polimerazami DNA, dotychczasowe wyniki sugerują, że REV1 wraz z polimerazą DNA ζ może zapobiegać transwersjom G:C-C:G . Takie systemy zapobiegające mutacjom są obserwowane w innych polimerazach DNA.

Reakcja oligonukleotydów zawierających oz z enzymami naprawczymi

Komórki wykorzystują szereg mechanizmów zapobiegających mutagennym skutkom wyżej opisanych rodzajów uszkodzeń DNA, i posiadają różne enzymy naprawiające uszkodzenia DNA, takie jak 8-oxoG .

E. coli formamidopyrimidine DNA glikozylazy i endonukleazy III enzymy excise Oz z dwuniciowych oligomerów DNA . Ponadto, ludzkie NTH1 i NEIL1, które są homologami endonukleaz III i VIII E. coli, usuwają Oz równie skutecznie jak 5-hydroksyuracil, a ich reaktywność wobec Oz jest wyższa niż wobec 8-oxoG. Ponieważ Oz jest bardziej wrażliwy niż 8-oxoG na traktowanie piperydyną, ta różnica w reaktywności zależy od siły wiązania N-glikozydowego .

Przeanalizowaliśmy aktywność innych enzymów naprawczych w stosunku do Oz. Glikozylaza dimeru pirymidynowego wirusa Chlorella, która wykazuje aktywność cięcia wobec cyklobutanowego dimeru pirymidynowego, reaguje z dwuniciowym DNA zawierającym Oz. Jej reaktywność wobec Oz jest wyższa niż wobec 8-oxoG, co wskazuje, że reaktywność zależy od siły wiązania N-glikozydowego, podobnie jak w przypadku ludzkich NEIL1 i NTH1 . Jednakże, ten enzym naprawczy wykazuje umiarkowaną aktywność wobec Oz w porównaniu z jego aktywnością wobec dimeru cyklobutanopirymidynowego .

Endonukleaza IV, endonukleaza apurynowa/apirymidynowa, nacinała Oz z obserwowaną aktywnością jedną trzecią do jednej czwartej aktywności wobec THF , ale z większą wydajnością niż jej aktywność wobec Gh. Wyniki te sugerują, że Oz może być strukturalnie bardziej podobna do miejsca abazowego niż Gh .

Endonukleaza V, która wykazuje aktywność wobec reszt hipoksantynowych, jest również aktywna wobec Oz. Aktywność ta jest niższa niż wobec hipoksantyny przy wysokich stężeniach endonukleazy V, ale endonukleaza V rozpoznaje Oz znacznie wydajniej niż Gh. Endonukleaza V może rozpoznać uracyl, ale nie tyminę, co sugeruje, że grupa 5′-metylowa jest krytyczna dla rozpoznania przez endonukleazę V. Jak opisano wcześniej, w przeciwieństwie do zamkniętej struktury pierścieniowej Oz (Rys. 1), Gh posiada cząsteczkę wystającą z pierścienia, podobnie jak tymina. Tak więc endonukleaza V może rozpoznawać Oz, ale nie Gh.

Człowiek OGG1 i endonukleaza AP 1 nie mogą wycinać reszt Oz, a monofunkcyjna glikozylaza uracylowo-dNA 1 nie wykazuje aktywności cięcia wobec Oz (dane nie pokazane). E. coli Mut Y nie może działać na zmiany Oz:G i Oz:A (dane nie pokazane). Oz jest słabym substratem dla ludzkiej naprawy wycinania nukleotydów, ponieważ uszkodzone miejsce jest mniej nieporęczne niż fotoprodukty pirymidynowe (6-4) pirymidonu, co utrudnia XPC-RAD23B rozpoznanie Oz .

Dostępne do tej pory dane wskazują, że ludzkie NEIL1 i NTH1 są najbardziej prawdopodobnymi enzymami naprawczymi dla Oz. Jednakże ludzkie NEIL1, NTH1, endonukleaza III E. coli i glikozylaza formamidopirymidynowa DNA mogą usunąć Oz z dwuniciowego DNA, niezależnie od rodzaju zasady przeciwnej do Oz. Jeśli zasadą przeciwną do Oz jest adenina, guanina lub tymina przed naprawą przez wycięcie zasad, informacja genetyczna jest zmieniana w kolejnych replikacjach. Tak więc, mogą istnieć nieznane enzymy, które mogą dokładnie usuwać Oz z oligonukleotydów, w których Oz jest sparowany z C, tak jak ludzki OGG1 może usuwać 8-oxoG. Alternatywnie, jak wspomniano wcześniej, REV1-DNA polimeraza ζ może zapobiegać transwersji G:C-C:G.

Czy OzOz przeszkadza w syntezie DNA przez polimerazy DNA?

Kontrastujące guaniny (GG), które występują w wielu ważnych regionach genomowych, takich jak onkogen K-ras, łatwiej ulegają utlenieniu niż pojedyncza guanina z powodu ich niższego potencjału redoks. Utlenianie sekwencji GG w warunkach wysokiego utleniania skutkuje powstaniem ciągłej utlenionej zmiany guaninowej. Wcześniej donosiliśmy, że IzIz powstaje w wyniku utleniania GG w jedno- i dwuniciowym DNA, co sugeruje, że hydroliza tych cząsteczek Iz powoduje powstanie dwóch przylegających do siebie cząsteczek Oz (OzOz). Oczekuje się, że OzOz zatrzymuje syntezę DNA bardziej efektywnie niż pojedynczy Oz, a zatem stanowi poważniejsze uszkodzenie DNA niż pojedynczy Oz.

Nasza analiza wykazała, że polimeraza DNA κ nie włączyła żadnego nukleotydu naprzeciwko OzOz . Fragment exo Klenowa preferencyjnie wbudowywał jedną adeninę naprzeciwko 3′ Oz zmian OzOz, REV1 wbudowywał cytozynę, a polimeraza DNA β wbudowywała guaninę. Polimeraza DNA α włączyła guaninę, adeninę i cytozynę naprzeciwko 3′ Oz zmian OzOz, przy czym guanina była włączana łatwiej niż adenina i cytozyna. Polimeraza DNA ι w niewielkim stopniu włączała guaninę, adeninę i tyminę. Niezależnie od tego, czy zasada jest włączona, czy nie, polimerazy te nie mogą wydłużyć primera do pełnej długości przez OzOz .

W przeciwieństwie do tego, polimeraza DNA η wydłużyła primer do pełnej długości przez OzOz z umiarkowaną wydajnością w porównaniu do zmian w cyklobutanowych dimerach pirymidynowych, przy czym synteza większości nici DNA zatrzymała się na 3′ lub 5′ OzOz . W przeciwieństwie do tego, polimeraza DNA ζ mogła wydajnie wydłużać primer do pełnej długości przez OzOz, co sugeruje, że polimeraza DNA ζ jest ważnym enzymem w syntezie translecji obok zarówno pojedynczych, jak i sąsiadujących cząsteczek Oz. Ponadto, polimeraza DNA ζ włącza wszystkie nukleotydy naprzeciwko 3′ i 5′ Oz i jest podatną na błędy polimerazą DNA dla OzOz.

Fotooksydacja w kwadrupleksowym DNA

Sekwencje bogate w guaninę, takie jak telomery, mogą składać się w struktury kwadrupleksowe. W dwuniciowym DNA jednoelektronowe utlenianie guaniny w sąsiadujących sekwencjach guaninowych jest zależne od lokalizacji najwyżej zajętego orbitalu molekularnego (HOMO). W przeciwieństwie do dwuniciowego DNA, 3′-guanina w d(TGGGGT) jest głównie utleniana w kwadrupleksowym DNA, a szacowany HOMO jest zlokalizowany na 3′-guaninie (Rys. 4b). Biorąc pod uwagę nasze obecne rozumienie dwuniciowego DNA i kwadrupleksowego DNA, selektywne jednoelektronowe utlenianie guaniny zachodzi w zlokalizowanym HOMO niezależnie od struktury DNA.

Z drugiej strony, produkty utleniania guaniny zależą od struktury DNA. Na przykład, Iz jest głównym produktem w jednoniciowym DNA, podczas gdy 8-oxoG i dehydroguanidinohydantoina (Ghox) powstają głównie w kwadrupleksowym DNA . Iz, 8-oxoG, Ghox i Gh powstają w dwuniciowym DNA i są również głównymi produktami utleniania występującymi w jednoniciowym i kwadrupleksowym DNA .

Mechanizm utleniania guaniny w jednoniciowym, dwuniciowym i kwadrupleksowym DNA można wyjaśnić następująco. W wyniku jednoelektronowego utleniania guaniny powstaje kation rodnikowy guaniny (G-+), po czym następują dwie ścieżki degradacji (Rys. 5). W jednym z nich G-+ ulega deprotonacji w pozycji N1, po czym powstaje Iz. W innej ścieżce G-+ ulega uwodnieniu i deprotonacji, po czym powstają 8-oxoG, Ghox i Gh. Między protonem N1 G-+ a O6 guaniny w kwadrupleksowym DNA istnieje wiązanie wodorowe (Rys. 6a), a w dwuniciowym DNA między protonem N1 G-+ a N3 cytozyny powstaje wiązanie wodorowe (Rys. 6b). Deprotonacja G-+ jest więc znacznie zahamowana w kwadrupleksowym DNA i częściowo zahamowana w dwuniciowym DNA. Oceniamy, że łatwość deprotonacji przebiega zgodnie z kolejnością: jednoniciowe DNA > dwuniciowe DNA > kwadrupleksowe DNA , i ta kolejność wyjaśnia różnice w produktach utleniania w każdym typie struktury DNA.