Uwalnianie acetylocholiny przez impulsy nerwowe może być zablokowane przez toksynę botulinową, bardzo silną substancję chemiczną, która jest wytwarzana w żywności skażonej przez bakterie Clostridium botulinum i jest sporadyczną przyczyną ciężkiego zatrucia pokarmowego (botulizmu). Najpoważniejszym skutkiem jest paraliż mięśni szkieletowych. Jednakże, gdy toksyna botulinowa jest wstrzykiwana miejscowo, może być stosowana w leczeniu silnych skurczów mięśni lub silnego, niekontrolowanego pocenia się. Pod takimi nazwami handlowymi jak Botox, jest ona również stosowana w celach kosmetycznych; toksyna botulinowa wstrzyknięta miejscowo sparaliżuje mięśnie twarzy, rozluźniając w ten sposób skórę i zmniejszając zmarszczki.

Wiele leków wchodzi w interakcje z receptorami acetylocholiny. Acetylocholina sama w sobie wywołuje bardzo krótkotrwałe efekty, ponieważ jest szybko niszczona we krwi. Jednym z acetylocholino-podobnych leków stosowanych w terapii jest pilokarpina, selektywny agonista receptorów muskarynowych, stosowana w kroplach do oczu w celu zwężenia źrenicy i obniżenia ciśnienia wewnątrzgałkowego, które jest podwyższone w jaskrze.

Antagoniści działający na receptory muskarynowe obejmują takie leki jak atropina i skopolamina. Leki te tłumią wszystkie działania układu przywspółczulnego, co powoduje wysychanie wydzielin organizmu (np. śliny, łez, potu, wydzieliny oskrzelowej, wydzieliny przewodu pokarmowego); rozluźnienie mięśni gładkich jelit, oskrzeli i pęcherza moczowego; wzrost częstości akcji serca; rozszerzenie źrenic; porażenie ostrości wzroku. Leki te są szeroko stosowane do wysuszania wydzieliny i rozszerzania oskrzeli podczas znieczulenia oraz do rozszerzania źrenic podczas zabiegów okulistycznych. Skopolamina jest również stosowana w leczeniu choroby lokomocyjnej, efekt, który zależy od jej zdolności do depresji aktywności ośrodkowego układu nerwowego.

Nikotyna, główny uzależniający składnik tytoniu używanego w papierosach i cygarach, wywiera swoje działanie na podzbiór receptorów cholinergicznych znanych jako receptory nikotynowe. Środki, które blokują te receptory, tzw. antagoniści receptorów nikotynowych, dzielą się na te, które działają głównie na mięśnie szkieletowe i te, które działają na komórki zwojów nerwowych. Do tej drugiej grupy należą heksametonium i trimetafan. Leki te powodują ogólne porażenie autonomicznego układu nerwowego, ponieważ nie rozróżniają zwojów współczulnych i przywspółczulnych i dlatego nie są specyficzne w swoim działaniu. Były one pierwszymi skutecznymi środkami obniżającymi wysokie ciśnienie krwi (leki przeciwnadciśnieniowe), ale mają wiele uciążliwych działań niepożądanych związanych z porażeniem autonomicznego układu nerwowego (np. niewyraźne widzenie, zaparcia, impotencja, niemożność oddania moczu). Zostały one zastąpione przez bardziej selektywne leki. Antagoniści receptora nikotynowego, którzy działają na złączu nerwowo-mięśniowym, są wykorzystywani podczas zabiegów chirurgicznych w celu uzyskania zwiotczenia mięśni.

Acetylocholina jest inaktywowana przez enzym acetylocholinoesterazę, który znajduje się w synapsach cholinergicznych i rozbija cząsteczkę acetylocholiny na cholinę i octan. Jedna z grup inhibitorów acetylocholinoesterazy (leki antycholinesterazowe) jest stosowana w leczeniu miastenii gravis, zaburzenia charakteryzującego się osłabieniem mięśni. Neostygmina i pirydostygmina są lekami, które mogą dotrzeć do złącza nerwowo-mięśniowego, ale nie mogą dostać się do zwojów autonomicznego układu nerwowego, a zatem nie przekraczają bariery krew-mózg. Dlatego też środki te przedłużają działanie acetylocholiny specyficznie na złączu nerwowo-mięśniowym.