Cardellini otrzymała swoją pierwszą dużą rolę w 1996 roku, kiedy wylądowała w głównej roli jako Sarah w sobotnim porannym serialu ABC dla dzieci, Bone Chillers. Następnie wystąpiła gościnnie w takich programach jak Krok za krokiem, Clueless, Trzecia skała od słońca i Boy Meets World jako Lauren, dziewczyna, która pojawiła się między gwiazdorską parą. Cardellini wystąpiła w pierwszym sezonie serialu AMC The Lot w 1999 roku, a lato spędziła w Europie jako część objazdowej produkcji Lancelota, czternastowiecznej holenderskiej tragedii.
Cardellini odniosła swój pierwszy duży sukces, gdy wylądowała jedną z głównych ról w serialu NBC Freaks and Geeks, który zadebiutował w sezonie 1999-2000. Jako Lindsay Weir, student honorowy w środku kryzysu tożsamości, Cardellini zarobił pozytywną odpowiedź, która następnie katapultował ją do sławy. Cardellini zagrała w 2002 roku w adaptacji Scooby-Doo, w której wcieliła się w postać Velmy Dinkley z kreskówki. Później powtórzyła rolę Velmy w filmie Scooby-Doo 2: Monsters Unleashed z 2004 roku. W 2003 roku dołączyła do obsady dramatu szpitalnego ER jako Samantha Taggart, pielęgniarka z wolnym duchem. Cardellini grała w ER przez sześć sezonów, aż do finału serialu „And in the End…”, a wraz z obsadą zdobyła nagrodę TV Land ensemble Icon Award w 2009 roku.
Jej inne prace filmowe obejmują role w Dead Man on Campus, Strangeland, Good Burger, Legalna blondynka, Brokeback Mountain (za którą była nominowana do nagrody Gotham i Screen Actors Guild), a także główną rolę w filmie Happy Madison „Grandma’s Boy” jako Samantha. Była głosem Ursuli w fabularnej grze wideo Gladius, a także zagrała głos Bliss Goode w serialu animowanym ABC Rodzina Goode. W 2007 roku Cardellini została wybrana do roli zakochanej Clary w miniserialu CBS Comanche Moon, prequelu filmu Lonesome Dove z 1989 roku.
W 2010 i 2011 roku Cardellini powróciła na scenę z grupą komediową Dr. God w Los Angeles i San Francisco, pojawiła się w filmach Kill the Irishman i Super oraz zagrała w niezależnym filmie Return. Pojawiła się wraz z członkami obsady i producentami Freaks and Geeks oraz Undeclared na Paley Center for Media PaleyFest 12 marca 2011 roku. Od 15 czerwca 2012 r. do 15 lutego 2016 r. była głosem Wendy w serialu Disney Channel Gravity Falls.
Cardellini udziela głosu okresowo w podcaście i programie na żywo The Thrilling Adventure Hour, w segmentach Sparks Nevada: Marshal on Mars segments. W 2013 roku została wybrana do zagrania Sylvii Rosen, miłosnego zainteresowania Dona Drapera w serialu Mad Men. Za występ w Mad Men otrzymała nominację do Primetime Emmy Award dla Outstanding Guest Actress in a Drama Series. Od 2015 roku dołączyła do Kyle’a Chandlera w nowym serialu dramatycznym Netflixa Bloodline, od twórców Damages. Program został anulowany w 2016 roku i zakończył się po trzecim sezonie. W tym samym roku miała również główną rolę jako Sara Whitaker w filmie komediowym Daddy’s Home. W 2017 roku powtórzyła swoją rolę w sequelu filmu Daddy’s Home 2.
W sierpniu 2018 roku Cardellini została obsadzona do współgrania z Christiną Applegate w mrocznym serialu komediowym Netflixa Dead to Me. Jego premiera odbyła się 3 maja 2019 roku. Za swój występ otrzymała uznanie krytyków i nominację do nagrody Primetime Emmy dla wybitnej aktorki pierwszoplanowej w serialu komediowym.
W 2019 roku wystąpiła w horrorze Klątwa La Llorony.
W 2019 roku wystąpiła w horrorze Klątwa La Llorony.