Hormonalna produkcja tarczycy składa się z tyroksyny lub T4 (80%) i trójjodotyroniny lub T3 (20%). W obiegu, cały T4 pochodzi z wydzielania tarczycy, ale większość T3 (80%) jest produkowany pozatarczycowo z dejodynacji T4. Konwersja T4 do T3 może być zależna od różnych czynników, a krążące T3 jest mniej wiarygodnym odzwierciedleniem produkcji hormonów tarczycy niż T4. W surowicy większość T4 i T3 jest związana z białkami wiążącymi, a tylko 0,02% T4 i 0,3% T3 jest wolne. Ze względu na ich wyższą skuteczność diagnostyczną, pomiary wolnego T4 (FT4) i wolnego T3 (FT3) zastąpiły oznaczenia hormonów całkowitych (wolne + związane). Pomiary hormonów całkowitych są nadal przydatne w badaniach naukowych lub w przypadku ciężkiej nadczynności tarczycy. Dializa równowagowa/RIA jest uznawana za metodę referencyjną dla pomiarów wolnych hormonów. Rutynowe laboratoria kliniczne stosują zautomatyzowane bezpośrednie dwuetapowe lub jednoetapowe testy immunologiczne z wysokocząsteczkowym ligandem lub znakowanym przeciwciałem. Pomiar wolnych hormonów pozostaje technicznie wymagający, szczególnie w surowicy pacjentów z ciężką chorobą tarczycy, z niską zdolnością wiązania tyroksyny w surowicy. Zakłócenia związane z przeciwciałami przeciwko hormonom tarczycy i rodzinną hipertyroksynemią dysalbuminemiczną zależą od metody oznaczania, ale są obecnie mniej wyraźne i rzadziej wykrywane. Aby móc prawidłowo zinterpretować wyniki oznaczenia, konieczna jest ocena jego działania w biologicznie i klinicznie dobrze scharakteryzowanych próbkach surowicy. Pomiary FT4 i FT3, jeśli FT4 jest prawidłowe, a podejrzewa się nadczynność tarczycy, służą do potwierdzenia i oceny stopnia niedoczynności i nadczynności tarczycy (jawnej lub subklinicznej). W przypadku niestabilnego stanu tarczycy (pierwsze miesiące leczenia przeciwtarczycowego, zmiana dawki L-T4, podostre zapalenie tarczycy) lub zaburzonej funkcji podwzgórzowo-przysadkowej (niedoczynność ośrodkowa) oznaczanie TSH jest diagnostycznie mylące, a miarodajne dla oceny funkcji tarczycy są jedynie pomiary wolnych hormonów.