DISCUSSION
Amplifikacja kwasów nukleinowych przy użyciu RT-PCR lub innych technik zapewnia dokładniejszą diagnozę zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych niż wcześniej dostępne techniki, takie jak hodowla wirusów. Wraz z dostępnością tych czułych technik diagnostycznych, wiele próbek płynu mózgowo-rdzeniowego jest obecnie przekazywanych do badania kwasów nukleinowych EV. Monitorowaliśmy profil płynu mózgowo-rdzeniowego, w tym liczbę leukocytów i poziom białka, aby pomóc w ocenie wydajności EV RT-PCR stosowanego w naszym laboratorium. Obecnie przeanalizowaliśmy dane oparte na próbkach przesłanych do EV RT-PCR w ciągu 3 lat od 2001 do 2003 roku, aby ponownie ocenić związek między parametrami płynu mózgowo-rdzeniowego a obecnością infekcji EV w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W jednym z tych lat na naszym terenie wystąpiło duże ognisko WNV, co pozwoliło nam ocenić wpływ obecności innego patogenu neurotropowego na związek między nieprawidłowościami w profilu płynu mózgowo-rdzeniowego a ewentualną obecnością EV RT-PCR. Nasze wyniki mogą być przydatne dla klinicystów i pracowników laboratoriów, którzy chcą zoptymalizować wykorzystanie testów na obecność kwasów nukleinowych EV.
Głównym przedmiotem naszego badania była zależność między liczbą leukocytów w CSF a wynikami EV RT-PCR. Interesowało nas określenie odsetka pacjentów z infekcją EV w OUN i podwyższoną liczbą leukocytów w płynie mózgowo-rdzeniowym. Chcieliśmy również określić odsetek pacjentów z podwyższoną liczbą leukocytów w płynie mózgowo-rdzeniowym, która została wyjaśniona przez infekcję EV. Nasze dane pokazują, że obie te proporcje są silnie uzależnione od wieku. Stwierdzenie braku pleocytozy CSF w próbkach CSF, które były pozytywne dla EV RNA, było w dużej mierze ograniczone do niemowląt poniżej 2 miesięcy życia i było dość powszechne (28%) w tej grupie wiekowej, prawdopodobnie odzwierciedlając niedojrzałość immunologiczną tych pacjentów. Kuszące jest spekulowanie, że odpowiedź chemokinowa wymagana do rekrutacji leukocytów do miejsca zakażenia nie była jeszcze rozwinięta u tych pacjentów. Wśród starszych pacjentów u mniej niż 2% osób z zakażeniem EV w OUN nie stwierdzono pleocytozy. I odwrotnie, stwierdzenie pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym z ujemnym wynikiem RT-PCR EV było częstsze w próbkach od starszych pacjentów. Nie jest zaskoczeniem, że to odkrycie było również bardziej powszechne w sezonie, w którym wystąpiło duże ognisko choroby WNV w obszarze obsługiwanym przez nasze laboratorium.
Wcześniejsze mniejsze badania również koncentrowały się na porównaniu wyników EV RT-PCR i parametrów płynu mózgowo-rdzeniowego. Henquell i wsp. (5) przedstawili dane 61 pacjentów z objawami zapalenia opon mózgowych i porównali wyniki hodowli EV i PCR z wynikami badania płynu mózgowo-rdzeniowego. Pięćdziesięciu sześciu z 61 pacjentów (92%) było PCR dodatnich, ale 9 pacjentów w wieku > 1,5 roku miało liczbę komórek w płynie mózgowo-rdzeniowym <10 komórek/mm3 i było PCR lub hodowla dodatnia. Tak więc w ich badaniu korelacja między pleocytozą a pozytywnością EV RT-PCR nie była dobra. Böttner i wsp. (2) opisali kohortę 70 pacjentów z objawami zapalenia opon mózgowych w lecie 2000 roku. W tym badaniu, 29 (46%) z 61 testów EV RT-PCR na płynie mózgowo-rdzeniowym było pozytywnych. Liczba komórek w płynie mózgowo-rdzeniowym wahała się od 2 do 1820 komórek/mm3, przy średniej wynoszącej 151. Autorzy donoszą, że nie było różnic w wynikach badań laboratoryjnych między pacjentami, u których uzyskano pozytywny wynik EV RT-PCR, a tymi, u których wynik był negatywny, ale nie podali szczegółowych danych dotyczących liczby komórek w płynie mózgowo-rdzeniowym. Wyjaśnienie różnic między wynikami tych badań a wynikami obecnego badania nie jest jasne, ale może odzwierciedlać biologiczne różnice w wykrywanych EV lub różne charakterystyki działania testów EV RT-PCR.
Jednym z interesujących aspektów obecnego badania jest skupienie uwagi na przyczynach pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjentów, u których wynik testu EV RT-PCR jest ujemny. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że test może nie wykrywać wszystkich infekcji EV. Nie znamy rzeczywistej czułości analitycznej (molekularnej) testu Chemicon w zakresie jego zdolności do wykrywania niskich poziomów wirusowego RNA. Zbadaliśmy czułość i stwierdziliśmy, że jest ona rzędu 2,0 razy większa od 50% dawki zakaźnej w hodowli tkankowej, ale nie wiemy ile genomów EV to reprezentuje, ani nie wiadomo ile cząstek nieinfekcyjnych jest produkowanych w ostrej infekcji w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym. Jednak jest mało prawdopodobne, aby było to jedyne wyjaśnienie, ponieważ w naszym badaniu 21 z 148 pacjentów (14%), którzy byli ≤2 miesiące i 169 z 549 pacjentów (31%), którzy byli >2 miesiące mieli pleocytozę i byli negatywni EV RT-PCR. Wykazano, że startery i sonda użyte w naszym badaniu wykrywają wszystkie oprócz 6 z 64 znanych EV, które zarażają ludzi (13). Jeden EV, coxsackievirus A15, nie był dostępny do testowania, a dwa inne, które nie zostały wykryte za pomocą tej kombinacji primera i sondy, echowirusy 22 i 23, zostały od tego czasu przeklasyfikowane na parechowirusy (16). Sześć EV, które nie zostały wykryte, są epidemiologicznie rzadkie. Inne infekcje, takie jak HSV, EBV i WNV, zostały zdiagnozowane u niektórych pacjentów z pleocytozą, ale stanowiły tylko 18 infekcji lub 23% wszystkich pacjentów w tym badaniu z pleocytozą i ujemnym wynikiem EV RT-PCR w 2002 roku (n = 77). Jest możliwe, że niektórzy z pozostałych pacjentów mieli infekcje innymi czynnikami zakaźnymi, takimi jak parechowirusy (16). Dodatkowo, niektóre z obserwowanych przypadków pleocytozy w tym badaniu mogły być spowodowane nieinfekcyjnymi przyczynami pleocytozy, w tym reakcjami na leki, takie jak kotrimoksazol, niesteroidowe środki przeciwzapalne i dożylne immunoglobuliny. Bakteryjna infekcja dróg moczowych również została uznana za przyczynę pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym u dzieci (18).
Rozważano wykorzystanie poziomu białka w płynie mózgowo-rdzeniowym jako wskaźnika dodatniej wartości EV RT-PCR. Jednakże dane wykazały, że poziom białka w płynie mózgowo-rdzeniowym nie był ani czuły, ani swoisty, gdy był stosowany sam, ani nie zwiększał czułości lub swoistości, gdy był stosowany w połączeniu z pleocytozą. Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika wykazały, że sam poziom białka w płynie mózgowo-rdzeniowym nigdy nie miał więcej niż 80% specyficzności na żadnym z badanych poziomów odcięcia, a w żadnej grupie wiekowej ani na żadnym z trzech badanych poziomów zarówno czułość, jak i specyficzność nie przekraczały 80%. Najlepsza korelacja między poziomami białek CSF a pozytywnością EV RT-PCR wystąpiła u pacjentów, którzy mieli >2 miesiące przy 80% normalnego odcięcia, gdzie czułość wynosiła 68%, a swoistość 78%.
Obieg WNV w społeczności podczas sezonu EV 2002 był potencjalnie czynnikiem zakłócającym w użyciu markerów CSF jako korelatów pozytywności EV RT-PCR. Rzeczywiście, dane z-testu w tabeli Table33 potwierdzają, że istniały znaczące różnice między danymi z sezonów 2001 i 2002 w zakresie swoistości samej pleocytozy lub pleocytozy i / lub podwyższonego poziomu białka jako korelatów dodatniej EV RT-PCR, być może z powodu obecności WNV w St. Louis w sezonie 2002. W 2002 roku było 67 próbek CSF od pacjentów, którzy mieli >2 miesiące, którzy mieli pleocytozę i byli negatywni w EV PCR. Spośród nich, 10 (15%) było dodatnich dla WNV i 18 (27%) było dodatnich dla WNV lub innego wirusa. Jeśli wszystkie 18 z tych fałszywie dodatnich wyników zostało usuniętych z obliczeń z 2002 roku, swoistość i PPV wzrosły odpowiednio z 56% i 23% do 63% i 29%. Swoistość i PPV dla wszystkich próbek od pacjentów, którzy mieli > 2 miesiące w 2001 roku wynosiły odpowiednio 62% i 66%. Usunięcie wyników fałszywie dodatnich, które można przypisać obecności innych wirusów, nadal nie wyjaśnia spadku PPV z roku 2001 do 2002. Muszą tu działać inne nieznane czynniki. Tak więc obecność innej przyczyny (zakaźnej lub innej) pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w społeczności zmniejsza zdolność laboratorium do przewidywania pozytywności EV na podstawie wyników badania płynu mózgowo-rdzeniowego.
Oprócz skupienia uwagi na przyczynach pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym innych niż zakażenie EV, wyniki tego badania mają dwa praktyczne zastosowania. Po pierwsze, laboratoria wykonujące EV RT-PCR mogą wykorzystać porównanie wyników RT-PCR z liczbą komórek w płynie mózgowo-rdzeniowym do opracowania metryk, które mogą być wykorzystane jako część programu zapewnienia jakości dla tego testu. W oparciu o nasze doświadczenie, jedna z metryk mówi, że EV RT-PCR powinna być pozytywna u około 75% niemowląt w wieku poniżej 2 miesięcy z pleocytozą w płynie mózgowo-rdzeniowym, u około 65% niemowląt i dzieci w wieku od 2 miesięcy do 18 lat z pleocytozą w płynie mózgowo-rdzeniowym oraz u około 25% pacjentów w wieku powyżej 18 lat z pleocytozą w płynie mózgowo-rdzeniowym. Liczby te uzyskano na podstawie danych z dwóch sezonów, w których WNV nie występował lub występował niezbyt często. Obieg znanych lub nowych arbowirusów lub innych wirusów, które mogą powodować zapalenie opon mózgowych powinien być brany pod uwagę przy analizie danych związanych z tą metryką, ponieważ spowoduje to zmniejszenie odsetka pacjentów z pleocytozą, którzy mają dodatni wynik EV RT-PCR. Laboratoria, które nie spełniają tego standardu, mogą odnieść korzyści z badania czułości analitycznej swojego testu, ale powinny również zwracać uwagę na możliwą obecność innych czynników, które mogą powodować pleocytozę w płynie mózgowo-rdzeniowym.
Drugą metryką, która może być wykorzystana do kontroli jakości jest to, że test EV RT-PCR powinien być ujemny u około 98% pacjentów w wieku powyżej 2 miesięcy, którzy nie mają pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym i u około 70% pacjentów w wieku poniżej 2 miesięcy bez pleocytozy. Wykrycie EV RNA u większego odsetka pacjentów bez pleocytozy powinno skłonić laboratoria do rozważenia, czy nie doszło do kontaminacji metodą PCR. Należy jednak zauważyć, że odsetki te będą się prawdopodobnie różnić w zależności od regionu, populacji pacjentów, rodzaju badania diagnostycznego i pory roku, prawdopodobnie w zależności od EV, które krąży.
Drugim praktycznym zastosowaniem wyników obecnego badania jest to, że laboratoria mogą wykorzystać te dane do ustalenia kryteriów maksymalizujących skuteczność testów EV RT-PCR. Na przykład, ponieważ brak pleocytozy ma wartość predykcyjną większą niż 98% dla negatywnego wyniku RT-PCR u pacjentów powyżej 2 miesiąca życia, laboratoria mogą zdecydować się na ustalenie wartości granicznej dla testów EV RT-PCR w oparciu o obecność lub brak pleocytozy. Wykorzystując dane z obecnego badania, zastosowanie tego punktu odcięcia spowodowałoby wykluczenie 223 z 549 próbek (w oparciu o 549 próbek od pacjentów w wieku >2 miesięcy, dla których dostępna była liczba komórek w płynie mózgowo-rdzeniowym), z niewykryciem tylko 3 próbek dodatnich (1,3%), które znalazłyby się w wykluczonej grupie 223 próbek. Trzech pacjentów z infekcją EV, ale bez pleocytozy, miało 5 miesięcy, 10 lat i 15 lat. Jeden z tych pacjentów (10-letni) był podejrzewany o zapalenie opon mózgowych EV z powodu sztywności karku, ale pozostali dwaj mieli objawy, które były mniej wyraźnie związane z zapaleniem opon mózgowych. Pacjent 10-letni prawdopodobnie zostałby przebadany w kierunku EV na podstawie podejrzenia klinicznego, a nie pleocytozy płynu mózgowo-rdzeniowego, ale pozostali dwaj mogliby nie zostać przebadani. We wszystkich trzech przypadkach dodatni wynik EV PCR nie miał znaczącego wpływu na postępowanie w sprawie. Jeśli środek taki jak zaproponowany przez nas zostanie przyjęty, zalecamy zastosowanie go do pacjentów powyżej 2 miesiąca życia i zapewnienie istnienia mechanizmu, który umożliwiłby przeprowadzenie badań w poszczególnych przypadkach z silnym klinicznym podejrzeniem zakażenia EV, niezależnie od wieku pacjenta lub obecności pleocytozy w płynie mózgowo-rdzeniowym. Oczywiście, program badań przesiewowych oparty na pleocytozie płynu mózgowo-rdzeniowego jest praktyczny tylko dla laboratoriów, których dostęp do danych dotyczących liczby komórek w płynie mózgowo-rdzeniowym jest na tyle szybki, że zastosowanie kryterium przesiewowego nie opóźniłoby wykonania badania. Poprzednie badania wyraźnie wykazały, że testy EV muszą być wykonywane w bardzo krótkim czasie, aby mogły mieć wpływ na podejmowanie decyzji klinicznych (14).