DISCUSSION

W tej pracy przedstawiamy struktury roztworu SAXS dla Hb i Hb sprzężonej z dwoma lub sześcioma do siedmiu kopiami 5-kD PEG. Jest to pierwszy przykład strukturalnego określenia 3D hemoglobiny skoniugowanej z PEG, aczkolwiek w niskiej rozdzielczości. Najważniejsze wnioski z tej pracy to: i), koniugacja PEG nie wywołuje żadnych poważnych zniekształceń struktury trzeciorzędowej Hb (w tej rozdzielczości), ale jej struktura czwartorzędowa wydaje się zagęszczona; ii), część łańcuchów PEG wchodzi w puste przestrzenie pomiędzy podjednostkami Hb, część pozostaje w pobliżu powierzchni białka, a reszta wystaje poza powierzchnię; iii), PEGylacja zmienia kulistą cząsteczkę Hb w wydłużoną strukturę z dwoma lub sześcioma sprzężonymi PEG; iv), sprzężenie PEG prowadzi do odpychania pomiędzy PEGylowanymi cząsteczkami Hb spowodowanego przez warstwę PEG otaczającą białko Hb, co objawia się wyraźnym efektem koncentracji w danych SAXS.

Doświadczalne rozpraszanie od Hb jest dobrze dopasowane do krzywej obliczonej na podstawie struktury krystalicznej oksyHb, podczas gdy struktura krystaliczna deoksyHb daje gorsze dopasowanie. Zarówno P5K2 jak i P5K6 s± sprzężone przy Cys-β93 przylegaj±cym do proksymalnej His-β92, która jest jedyn± reszt± w podjednostkach β Hb bezpo¶rednio skoordynowan± z żelazem hemowym. Wydaje się prawdopodobne, że przyłączenie 5-kD PEG powoduje lokalne, niewielkie zniekształcenia strukturalne kieszeni hemowej podjednostki β, które nie są wykrywalne w tej rozdzielczości (∼ 12 Å). Potwierdzają to badania kinetyki utraty hemu, która jest 5 razy większa dla podjednostki β P5K6 w porównaniu do nieskoniugowanej Hb, podczas gdy podjednostki α wykazują podobną kinetykę do Hb (8). Zgodnie z tą interpretacją, badania 1H NMR sprzężonej z PEG Hb, która jest podobna w strukturze chemicznej do badanej tu P5K6, wykazały przesunięcie proksymalnej histydyny podjednostek β, ale nie α (28). Co więcej, reszty w pobliżu Cys-β93 znajdują się w konformacyjnie plastycznym regionie, który jest bezpośrednio związany z właściwościami allosterycznymi Hb (29,30).

Modyfikacja reszt Cys-β93 samym N-etylo maleimidem powoduje utratę kooperatywności, a ten efekt, wraz z zagęszczeniem struktury czwartorzędowej, może wyjaśniać pozorną utratę kooperatywności w Hemospanie (5). Ruch czwartorzędowy może być ograniczony, dając początek tylko częściowemu przejściu między stanami R i T lub pośredniej strukturze czwartorzędowej. Taki efekt był rozważany wcześniej w celu interpretacji kinetyki wiązania O2 do Hemospanu (7).

Zważywszy, że szerokokątne części rozpraszania z Hb i PEG-Hb pokrywają się, znaczące zmiany struktury trzeciorzędowej/sekundowej spowodowane PEGylacją można wykluczyć, a nasze wyniki wskazują zatem na bardziej zwartą strukturę czwartorzędową białka PEGylowanego. Można to wyjaśnić częściową dehydratacją interfejsów międzypodjednostkowych spowodowaną przez łańcuchy PEG, które, dość nieoczekiwanie, są częściowo zlokalizowane we wnętrzu PEG-Hbs. Czwartorzędowa struktura oksyHb tworzy centralną jamę pomiędzy czterema podjednostkami hemoglobiny. Wnęka ta może pomieścić co najmniej 80 cząsteczek wody, jak wykazano w strukturze krystalicznej oksyHb o wysokiej rozdzielczości (27). W związku z tym, objętość jest wystarczająca, aby PEG mógł wejść do interfejsu międzypodjednostkowego i wyprzeć cząsteczki wody znajdujące się we wnętrzu tetrameru. Ponadto, PEG jest znany z tego, że powoduje dehydratację i jest często stosowany jako kosolwent do krystalizacji białek. W poł±czeniu z przemieszczeniem cz±steczek wody zlokalizowanych w centralnej wnęce, ogólna dehydratacja może przyczynić się do powstania zwartej struktury czwartorzędowej PEG-Hbs. Wniosek ten jest zgodny z symulacjami dynamiki molekularnej, które wykazały korelację pomiędzy zakresem PEGylacji i objętością molekularną PEG-Hb, z odpowiednim przemieszczeniem cząsteczek wody ze struktury Hb (31).

Jako że większa część łańcuchów PEG jest zlokalizowana poza Hb, nasze wyniki są zgodne z wcześniejszymi badaniami pokazującymi, że PEG jest preferencyjnie wykluczany z białek przez wykluczenie steryczne (32). Ponadto, ale w konkurencji z siłami wykluczającymi, wykazano, że PEG oddziałuje z niepolarnymi resztami powierzchni białek (32), a interakcja 5-kD PEG została zgłoszona do hydrofobowych klastrów na powierzchni cytochromu c (33). Wynik hydrofobowości dla Hb obliczono według Kyte’a i Doolittle’a (34) (Ryc. 6), pokazując numery reszt wyrównane z segmentami helikalnymi. Regionem szczególnie interesującym z punktu widzenia możliwych oddziaływań PEG-Hb jest obszar nad względnie hydrofobowymi helikaliami G-H przy kontaktach α1β1 pomiędzy dimerami. Nasze modele wykazują oddziaływania powierzchniowe PEG z Hb, chociaż rozdzielczość jest niewystarczająca do określenia zaangażowanych reszt Hb lub ich polarności. Analiza widm SAXS zarejestrowanych przy stosunkowo wysokim stężeniu białka wykazuje wyraźny efekt stężenia zarówno dla P5K2 jak i P5K6, podczas gdy efekt ten jest prawie nieobecny w przypadku nieskoniugowanej Hb. Jak można się było spodziewać, efekt stężenia jest wyraźniejszy dla P5K6 niż dla P5K2, co sugeruje, że wprowadzenie dodatkowych łańcuchów PEG powoduje lepsze ekranowanie cząsteczki Hb, co jest również zgodne z obliczeniami dynamiki molekularnej teoretycznych Hb sprzężonych z PEG (31).

Intuicyjnie można by oczekiwać, że PEG-Hbs będą miały taki sam kształt jak niePEGylowane Hb, ale tutaj pokazujemy, że kształt białka PEGylowanego nie jest określony przez kształt białka rdzeniowego. Niesferyczny kształt roztworu PEG-Hbs nie był przewidziany i dostarcza nowych informacji, na podstawie których można obliczyć stałe dyfuzji PEG-Hb przy użyciu równania Stokesa-Einsteina. Przedstawiliśmy symulacje transportu tlenu przez bezkomórkowe Hbs, w tym PEG-Hb, gdzie wykazano, że dyfuzja molekularna Hb jest jednym z krytycznych czynników w ogólnym transporcie tlenu (35). Chociaż wniosek jest słuszny, w badaniu tym przyjęto upraszczające założenie, że cząsteczki Hb są sferyczne. Ponieważ struktura roztworu SAXS zaprzecza temu założeniu, można teraz zastosować prawidłowe wymiary cząsteczek, aby zapewnić dokładniejsze symulacje.

Ponadto, chociaż zarówno P5K2 jak i P5K6 mają podobne kształty i ogólne wymiary, różnica w efekcie odpychania cząsteczek w roztworze zapewnia wysoce krytyczną właściwość, która może wyjaśniać niektóre z pozytywnych efektów PEGylowanych Hbs in vivo. Ogólność tych obserwacji można przypisać dołączonym łańcuchom PEG i sugeruje, że efekt stężenia jest ogólną konsekwencją koniugacji PEG. Zgodnie z tym, in vivo, można postawić hipotezę, że efekt ten nie tylko zapobiega interakcjom międzycząsteczkowym między sąsiednimi białkami sprzężonymi z PEG, ale także między białkami sprzężonymi i niesprzężonymi, a nawet strukturami komórkowymi.

Kilka ogólnych korzyści, takich jak zwiększony czas retencji wewnątrznaczyniowej, zmniejszona immunogenność i lepsza rozpuszczalność, często wiąże się z przyłączeniem polimeru PEG do białka. Na przykład, przyłączenie 40-kDa rozgałęzionego polimeru PEG do interferonu-β-1b znacznie poprawiło jego okres półtrwania w krążeniu z 1,1 h dla nieskoniugowanego białka do 9,4 h dla leku sprzężonego z PEG; ponadto, przyłączenie PEG dramatycznie zmniejszyło immunogenność białka i tendencję do agregacji (4). Zdolność PEG-Hb do wykluczania innych białek lub komórek w obrębie swojej wykluczonej objętości jest szczególnie krytyczna w projektowaniu terapii tlenowych. Produkty oparte na hemoglobinie są optymalizowane w celu wydłużenia czasu krążenia, przy jednoczesnym zminimalizowaniu lub wyeliminowaniu toksyczności. Wynik ten jest zgodny z wydłużonym okresem półtrwania Hemospanu w krążeniu, który wynosi ∼20 h przy braku hemoglobinurii (14), w porównaniu z bardzo szybkim klirensem nerkowym niemodyfikowanej, bezkomórkowej Hb (36). Wydłużenie czasu krążenia Hemospanu może wynikać z tego, że nie wiąże się on z receptorem makrofagów CD163, zmiataczem Hb, który wykazuje stopniowe zmniejszanie wiązania spolimeryzowanej Hb wraz ze wzrostem jej rozmiaru (37). Badania z Hemospanem w tym systemie są w toku. Ponadto, odpychanie PEG-Hb od innych komórek układu odpornościowego może mieć decydujące znaczenie dla uniknięcia odpowiedzi zapalnej. Przeważające teorie na temat indukowanego przez hemoglobinę bezkomórkową zwężenia naczyń krwionośnych są takie, że cząsteczki Hb zbliżają się do śródbłonka (38) lub wynaczyniają się przez śródbłonek (39), z których każda sprawiłaby, że zmiatanie NO byłoby bardziej efektywne, prowadząc w ten sposób do wzrostu napięcia naczyniowego i negatywnych efektów ubocznych w postaci nadciśnienia i zmniejszenia perfuzji (40). W tym momencie pozostaje to spekulacją, ale odpychająca natura modyfikacji PEG może zmniejszyć jej interakcję z powierzchniową glikokaliksą komórek śródbłonka; w ten sposób efekt odpychania stanowi wyjaśnienie dla zmniejszonej wazoaktywności z Hemospanem (10).

Te nowe spostrzeżenia z analizy SAXS mogą być teraz wykorzystane do zaprojektowania PEG-Hbs dla maksymalnych lub optymalnych efektów odpychania i wielkości cząstek oraz konformacji PEG. Międzycząsteczkowe siły odpychania znacznie wzrastają wraz z całkowitą masą sprzężonych PEG-ów o tej samej długości polimeru (10 vs. ∼ 30 kD dla P5K2 vs. P5K6), efekt ten nie był przewidywany przez zmiany kształtu cząsteczki i/lub wymiarów. Tak więc konformacje roztworu sprzężonych PEG-ów, które obejmują ich interakcje z Hb, innymi polimerami PEG i otaczającymi warstwami wody, muszą odgrywać dużą rolę w efekcie odpychania.

Efektywne długości PEG-ów są określone przez wymiar Flory’ego, RF, który jest określony na podstawie efektywnej długości jednostki oksyetylenowej, a = 3.5 Å (41), i liczby jednostek w polimerze, N (42-44):

Względne wymiary RF i odległość między miejscami szczepienia PEG, DG, na powierzchni określają strukturę drugorzędową szczepionego polimeru PEG: dla DG > RF, polimer PEG jest w stanie złożyć się na sobie nad zaszczepioną powierzchnią, dając konformację „grzybka”; dla DG < RF, PEG stają się wydłużone z powodu oddziaływań sterycznych między łańcuchami PEG, tworząc konformację „szczotki”; a przy DG ≈ RF, PEG znajdują się w fazie przejściowej „grzybek do szczotki” (45). Dla 5-kD PEG, N = 113 i RF ∼ 60 Å. Ponieważ pół-maksymalny obwód DG na powierzchni Hb od jednego Cys-β93 do drugiego na symetrycznie przeciwległej stronie Hb wynosi ∼110 Å, DG > RF, umożliwiając w ten sposób grzybkową konformację szczepionych polimerów PEG w P5K2. Znajduje to odzwierciedlenie w cechach PEG ze struktury SAXS P5K2, pokazując ogólny elipsoidalny kształt z Dmax = 115 Å. Obliczenie maksymalnej średnicy dla P5K2 przy użyciu wymiaru Flory’ego dla 5-kD PEG daje cząsteczkę z Dmax ∼ 190 Å (tj, średnica Hb = 70 Å + PEGs, 2 × 60 Å), dostarczając w ten sposób oszacowania dla konformacji grzybkowej łańcuchów PEG na P5K2, które składają się do ∼60% ich pełnych wymiarów Flory’ego.

Cząsteczka P5K6 o większej koordynacji z PEG zawiera dwa specyficzne miejsca przyłączenia (Cys-β93) i dodatkowe cztery do pięciu miejsc szczepienia PEG. Struktura roztworu SAXS sugeruje, że łańcuchy PEG w P5K6 mają większe oddziaływanie steryczne, tworząc jeszcze bardziej wydłużony kształt w porównaniu do P5K2 (Rys. 4). Stosując przybliżenie, że łańcuchy PEG są równomiernie rozmieszczone na powierzchni Hb, DG zmniejsza się do ∼55 Å, a DG ≈ RF, co sugeruje bardziej wydłużoną konformację PEG, ale nadal w przejściu grzybek-szczotka. Używając maksymalnego wymiaru Flory’ego w porównaniu do zmierzonego Dmax = 130 Å, 5-kD łańcuchy PEG na P5K6 wydają się składać do ∼70% ich pełnego wymiaru Flory’ego, co jest zgodne ze zwiększeniem wydłużenia PEG w P5K6 w porównaniu do P5K2 przez ograniczenia steryczne.

Bezpośrednie określenie wielkości cząsteczki za pomocą SAXS w połączeniu z analizą Flory’ego pozwoliło nam przewidzieć, że P5K6 znajduje się w fazie przejściowej grzyb-szczotka i dlatego nie został zaprojektowany tak, aby osiągnąć maksymalny rozmiar cząsteczki, gdy sprzężone PEG są w pełni rozciągnięte. Nowe cząsteczki PEG-Hb mogą być zaprojektowane dla większych cząstek, takich, że DG < RF albo przez: 1), tworzenie bardziej silnie sprzężonej Hb z większą ilością miejsc przyłączenia PEG, zmniejszając w ten sposób DG, albo 2), zwiększanie długości PEG, zwiększając w ten sposób RF. Podwojenie rozmiaru PEG do 10 kD (tj. P10Kx, gdzie x jest liczbą miejsc koniugacji), zwiększa RF do ∼90 Å, co według naszych przewidywań zapewni konformację grzybka w P10K2, ale zbliży się do konformacji pełniejszej szczotki w P10K6. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób wydłużenie długości polimeru PEG zmienia oddziaływania steryczne podczas reakcji koniugacji chemicznej PEG-Hb, dlatego nowe projekty wymagają przeprowadzenia eksperymentów ze stosunkami reakcji w połączeniu z badaniami SAXS w celu weryfikacji punktu przejścia od konformacji grzybkowej do szczotkowej.