Rekombinowane DNA (lub rDNA) powstaje przez połączenie DNA z dwóch lub więcej źródeł. W praktyce, proces ten często obejmuje łączenie DNA różnych organizmów. Proces ten zależy od zdolności do przecinania i ponownego łączenia cząsteczek DNA w miejscach, które są identyfikowane przez specyficzne sekwencje zasad nukleotydowych zwanych miejscami restrykcyjnymi. Fragmenty DNA są wycinane z ich normalnej pozycji w chromosomie za pomocą enzymów restrykcyjnych (zwanych również endonukleazami restrykcyjnymi), a następnie wstawiane do innych chromosomów lub cząsteczek DNA za pomocą enzymów zwanych ligazami.

Klonowanie genów

Opisuje to proces kopiowania fragmentów DNA, które mogą być następnie wykorzystane do wielu różnych celów, takich jak tworzenie upraw GMO lub znalezienie lekarstwa na chorobę. Istnieją dwa rodzaje klonowania genów: in vivo, które obejmuje użycie enzymów restrykcyjnych i ligaz przy użyciu wektorów i klonowanie fragmentów do komórek gospodarza (jak widać na powyższym obrazku). Drugi typ to in vitro, który wykorzystuje metodę łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) do tworzenia kopii fragmentów DNA.

W przypadku klonowania in vivo fragment DNA, zawierający pojedynczy gen lub kilka genów, jest wprowadzany do wektora, który może być amplifikowany w innej komórce gospodarza. Wektor jest odcinkiem DNA, który może zawierać inny fragment DNA bez utraty zdolności do samoreplikacji, a wektor zawierający dodatkowy fragment DNA jest znany jako wektor hybrydowy. Jeśli fragment DNA zawiera jeden lub więcej genów, proces ten określa się mianem klonowania genów.

Klonowanie DNA w plazmidach

Wydawca: Genome Management Information System, Oak Ridge National Laboratory, U.S. Department of Energy Genome Programs http://genomics.energy.gov

Istnieją 4 różne typy wektorów:

• Wektory plazmidowe
• Wektory fagowe Lamda (λ)
• Kosmidy
• Wektory ekspresyjne

Komórka gospodarza kopiuje sklonowane DNA wykorzystując własne mechanizmy replikacji. Jako gospodarze wykorzystywane są różne typy komórek, w tym bakterie, komórki drożdży i komórki ssaków.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Źródło: Andy Vierstraete

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Jest to metoda in vitro pozwalająca na wykonanie wielu kopii określonego odcinka DNA, bez konieczności stosowania wektorów czy komórek gospodarza. DNA, które ma być skopiowane – szablonowe DNA – jest mieszane ze starterami do przodu i do tyłu komplementarnymi do końca szablonowego DNA, nukleotydami i wersją polimerazy DNA znanej jako polimeraza Taq. (Enzym ten jest stabilny w wysokich temperaturach i jest uzyskiwany z termofilnej bakterii Thermus aquaticus). Proces obejmuje powtórzenie trzech etapów:

• denaturacja, która rozdziela dwie nici nukleotydów cząsteczki DNA
• wyżarzanie primera, w którym primery wiążą się z jednoniciowym DNA
• wydłużanie, w którym nukleotydy są dodawane do primerów – w kierunku od 5′ do 3′ – w celu utworzenia dwuniciowej kopii docelowego DNA.

Każdy cykl trwa kilka minut, a powtarzane cykle mogą wytworzyć duże ilości określonej sekwencji DNA w ciągu kilku godzin, a nie dni. Jednak ta metoda klonowania wymaga znajomości pewnych szczegółów dotyczących sekwencji nukleotydów, które mają być skopiowane, a technika ta jest bardzo wrażliwa na małe ilości zanieczyszczeń.

Biblioteki genów

Źródło: http://www.emunix.emich.edu/~rwinning/genetics/index.htm

Biblioteka genów to duży zbiór sklonowanych sekwencji DNA pochodzących z jednego genomu. Biblioteka genomowa, (jak widać powyżej) w teorii zawierałaby przynajmniej jedną kopię każdej sekwencji w genomie organizmu. Używa się ich do badania struktury danego chromosomu lub do klonowania konkretnych genów. Biblioteki tego typu mogą być przygotowywane z podzbioru całego genomu (np. pojedynczego chromosomu). Pierwszym krokiem w tworzeniu biblioteki genomowej jest rozbicie, lub „frakcjonowanie”, genomu przy użyciu metod fizycznych lub enzymów restrykcyjnych. Fragmenty są następnie łączone z odpowiednimi wektorami i klonowane w odpowiedniej populacji komórek gospodarza.

Biblioteka cDNA (komplementarnego DNA) zawiera DNA obecne w danej populacji komórek, które jest przygotowywane z mRNA (messenger RNA) przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy. Powstały w ten sposób cDNA reprezentuje geny wyrażone w populacji komórek jako podzbiór całego genomu i może być klonowany przy użyciu wektora i odpowiedniej komórki gospodarza (jak widać na powyższym schemacie). CDNA nie będzie zawierać intronów ani sekwencji regulatorowych, ponieważ są one usuwane z RNA podczas przetwarzania, co sprawia, że biblioteka cDNA jest łatwiejsza w utrzymaniu. Biblioteka cDNA może być również przygotowana przy użyciu PCR z odwrotną transkryptazą (RT-PCR).

Identyfikacja produktów genowych w bibliotece genowej

Enzymy restrykcyjne (do cięcia DNA) i elektroforeza żelowa (do oddzielenia powstałych fragmentów) mogą być użyte do wytworzenia fizycznej mapy segmentów DNA w procesie znanym jako mapowanie restrykcyjne. Przykład tego, jak może wyglądać jedna z nich, można zobaczyć poniżej.

Źródło: University of Leicester

Istnieje również szereg technik, które mogą być wykorzystane do identyfikacji konkretnych genów lub produktów genowych w obrębie biblioteki genowej i są to: Southern blotting, Northern blotting i Western blotting. Jednak najpotężniejszą techniką eksperymentalną do badania genetyki na poziomie molekularnym jest sekwencjonowanie DNA, które pozwala na określenie sekwencji nukleotydów genów, a nawet całych chromosomów. Zautomatyzowane technologie sekwencjonowania pozwalają nam obecnie na sekwencjonowanie całych genomów organizmów od bakterii po człowieka.

Genetyka molekularna i biotechnologia

Nowe techniki genetyki molekularnej, w połączeniu z rozwojem w powiązanych biotechnologiach, doprowadziły do postępu w wielu różnych dziedzinach. Obecnie możemy analizować genomy gatunków, które wnoszą istotny wkład w rolnictwo, produkcję paliwa lub opracowywanie leków. Możemy przenosić określone geny z jednego organizmu do drugiego, aby tworzyć transgeniczne rośliny i zwierzęta, a także wykorzystywać techniki klonowania zwierząt do produkcji zwierząt identycznych genetycznie, takich jak owca Dolly, a ostatnio także sklonowanych zwierząt domowych, takich jak koty i psy.

Proces klonowania jest prosty, ale wyniki nie zawsze są przewidywalne. Potrzeba było wielu setek prób, aby doprowadzić go do działania i wyprodukować jedną żywą owcę, a klonowanie samo w sobie rodzi wiele pytań nie tylko o korzyści i zagrożenia, ale także wiele pytań etycznych.

Diagram świń, aby pokazać, jak przeprowadza się klonowanie zwierząt. Źródło: National Human Genome Research Institute

Technika genetycznych odcisków palców, która umożliwia identyfikację osób i związków między osobami znalazła dziś wiele zastosowań w nauce. Prowadzone są również badania nad terapią genową, w ramach której bada się możliwość wprowadzenia sklonowanych genów w celu zrekompensowania wadliwych, zmutowanych genów. Inne obszary, na przykład klonowanie człowieka i badania nad komórkami macierzystymi, otwierają wiele problemów etycznych, które muszą być rozwiązywane równolegle z rozwojem nauki.

Wróć do góry

Ten utwór jest objęty licencją Creative Commons.