W latach 30-tych XX wieku nadal poszukiwano sposobu na wykorzystanie zarówno światła bezpośredniego jak i rozproszonego ze wszystkich azymutów, aby uzyskać obrazy o dobrym kontraście z obiektami niebarwionymi, które nie absorbują światła. Badania Fritsa Zernike w tym okresie odkryły różnice fazowe i amplitudowe pomiędzy światłem zerowego rzędu i światłem rozproszonym, które mogą być zmienione tak, aby stworzyć korzystne warunki dla interferencji i wzmocnienia kontrastu.

Niezabarwione próbki, które nie absorbują światła nazywane są obiektami fazowymi, ponieważ nieznacznie zmieniają fazę światła rozproszonego przez próbkę, zazwyczaj poprzez opóźnienie takiego światła o około 1/4 długości fali w porównaniu do światła bezpośredniego przechodzącego przez próbkę lub wokół niej bez wpływu. Niestety, nasze oczy, jak również klisze aparatów fotograficznych, nie są w stanie wykryć tych różnic fazowych. Oko ludzkie jest wrażliwe jedynie na kolory widma widzialnego (zmiany w częstotliwości światła) lub na różne poziomy natężenia światła (zmiany w amplitudzie fali).

W próbkach fazowych, bezpośrednie światło zerowego rzędu przechodzi przez próbkę lub wokół niej bez zniekształceń. Jednak światło rozproszone przez próbkę nie ulega zmniejszeniu amplitudy, jak to ma miejsce w przypadku obiektów pochłaniających światło, lecz jest spowalniane przez próbkę ze względu na współczynnik załamania światła lub grubość próbki (lub oba te czynniki). Światło rozproszone, opóźnione o około 1/4 długości fali, dociera do płaszczyzny obrazu w odstępie od światła rozproszonego, ale w wyniku interferencji nie traci na intensywności. W rezultacie obraz na poziomie okularu jest tak pozbawiony kontrastu, że szczegóły stają się prawie niewidoczne.

Zernike’owi udało się opracować metodę – obecnie znaną jako mikroskopia kontrastu fazowego – do robienia niebarwionych obiektów fazowych dających obrazy kontrastowe tak, jakby były obiektami amplitudowymi. Obiekty amplitudowe wykazują doskonały kontrast, gdy światło rozproszone i bezpośrednie nie są zgodne (wykazują różnicę faz) o 1/2 długości fali. Metoda Zernike’a polegała na przyspieszeniu światła bezpośredniego o 1/4 długości fali tak, że różnica długości fali pomiędzy światłem bezpośrednim a odchylonym dla próbki fazowej wynosiła 1/2 długości fali. W efekcie światło bezpośrednie i rozproszone docierające do płaszczyzny obrazowej okularu będzie w stanie wytworzyć interferencję destrukcyjną (patrz opisany wcześniej rozdział o powstawaniu obrazu dla obiektów absorbujących). Takie postępowanie powoduje, że szczegóły obrazu wydają się ciemniejsze na jaśniejszym tle. Jest to tzw. ciemny lub dodatni kontrast fazowy. Schematyczna ilustracja podstawowej konfiguracji mikroskopu z kontrastem fazowym jest przedstawiona na Rysunku 1.

Innym możliwym sposobem postępowania, znacznie rzadziej stosowanym, jest spowolnienie światła bezpośredniego o 1/4 długości fali, tak aby światło rozproszone i bezpośrednie docierały do okularu w jednym kroku i mogły interferować konstruktywnie. Taki układ daje jasny obraz szczegółów preparatu na ciemniejszym tle i nazywany jest kontrastem negatywnym lub jasnym.

Mikroskopia kontrastu fazowego odniosła wielki sukces i ostatecznie zyskała szerokie zastosowanie, co zaowocowało przyznaniem Zernike’owi prestiżowej nagrody Nobla z fizyki w 1953 roku. Technika kontrastu fazowego została okrzyknięta największym postępem w mikroskopii od stulecia. Kontrast fazowy, poprzez „przekształcenie” próbek fazowych, takich jak żywy materiał, w próbki amplitudowe, pozwolił naukowcom zobaczyć szczegóły w niebarwionych i/lub żywych obiektach z jasnością i rozdzielczością, jakiej nigdy wcześniej nie osiągnięto.

Metoda Zernike’a polega na oddzieleniu bezpośredniego światła zerowego rzędu od światła rozproszonego na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. W tym celu pierścień jest umieszczany bezpośrednio pod dolną soczewką kondensora na przedniej płaszczyźnie ogniskowej kondensora, zbieżnej z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu. Wydrążony stożek światła z pierścienia przechodzi przez próbkę bez zniekształceń i dociera do tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu w kształcie pierścienia świetlnego. Światło słabsze, rozproszone przez próbkę, jest rozpraszane na całej tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu.

Gdyby pozwolić tej kombinacji przejść do płaszczyzny obrazu w okularze, światło rozproszone byłoby o około 1/4 długości fali za światłem bezpośrednim. Na płaszczyźnie obrazu faza światła rozproszonego byłaby poza fazą światła bezpośredniego, ale amplituda ich interferencji byłaby prawie taka sama jak światła bezpośredniego. W rezultacie kontrast próbki byłby bardzo mały.

Aby przyspieszyć bezpośrednie światło zerowego rzędu, na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu instalowana jest płytka fazowa z przymocowanym do niej pierścieniowym przesuwnikiem fazowym. Wąski obszar płytki fazowej jest optycznie cieńszy niż pozostała część płytki. W rezultacie, światło nieodwrócone przechodzące przez pierścień fazowy pokonuje krótszą drogę przez szkło obiektywu niż światło rozproszone.

Teraz, gdy bezpośrednie światło nieodwrócone i światło rozproszone przechodzą do płaszczyzny obrazu, są one o 1/2 długości fali poza fazą. Światło rozproszone i bezpośrednie mogą się teraz destrukcyjnie interferować, tak że szczegóły okazują się ciemne na jaśniejszym tle (tak jak w przypadku okazów absorbujących lub amplitudowych). Jest to opis tego, co dzieje się w dodatnim lub ciemnym kontraście fazowym.

Jeśli pierścieniowy obszar przesuwnika fazy płytki fazowej byłby grubszy niż reszta płytki, światło bezpośrednie jest spowolnione o 1/4 długości fali. W tym przypadku, światło zerowego rzędu dociera do płaszczyzny obrazu w kroku (lub w fazie) ze światłem rozproszonym i zachodzi interferencja konstruktywna. Obraz będzie się wydawał jasny na ciemniejszym tle. Obraz wydaje się jasny na ciemniejszym tle. Ten rodzaj kontrastu fazowego jest opisywany jako kontrast negatywny lub jasny.

Ponieważ światło nieulegające zmianie rzędu zerowego jest znacznie jaśniejsze niż słabe światło rozproszone, na pierścieniu osadza się cienką, pochłaniającą, przezroczystą warstwę metaliczną, aby doprowadzić światło bezpośrednie i rozproszone do lepszej równowagi intensywności w celu zwiększenia kontrastu. Ponadto, ponieważ przyspieszenie lub spowolnienie światła bezpośredniego jest obliczane na 1/4 długości fali światła zielonego, obraz fazowy będzie wyglądał najlepiej, gdy na drodze światła zostanie umieszczony zielony filtr (preferowany jest zielony filtr interferencyjny). Taki zielony filtr pomaga również celom achromatycznym uzyskać najlepsze obrazy, ponieważ achromaty są sferycznie skorygowane dla światła zielonego.

Akcesoria potrzebne do pracy z kontrastem fazowym to podstopniowy kondensor kontrastu fazowego wyposażony w pierścienie oraz zestaw obiektywów kontrastu fazowego, z których każdy ma zainstalowaną płytkę fazową. Kondensor posiada zwykle pozycję jasnego pola z diafragmą aperturową oraz obrotową wieżyczkę z annulami (każdy obiektyw fazowy o różnym powiększeniu wymaga annulusa o coraz większej średnicy wraz ze wzrostem powiększenia obiektywu). Każdy obiektyw fazowy ma zaciemniony pierścień na tylnej soczewce. Takie obiektywy mogą być również używane do zwykłej pracy w jasnym polu w świetle przechodzącym z niewielką redukcją jakości obrazu.

Wyposażenie fazowe, dostarczane przez producenta, zwykle zawiera zielony filtr i teleskop fazowy. Ten ostatni jest używany, aby umożliwić mikroskopiście oświetlenie pierścienia kondensora w celu nałożenia go na pierścień płytki fazowej. Zestaw śrub centrujących w kondensorze substage pozwala na manipulowanie pierścieniem w celu wyrównania go podczas obserwacji tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu za pomocą teleskopu fazowego (lub przez soczewkę Bertranda).

Aby skonfigurować mikroskop fazowy (komórki okładzinowe policzka są łatwo dostępnym materiałem badawczym), należy ustawić ostrość próbki za pomocą obiektywu fazowego 10X. Następnie, skonfigurować mikroskop do oświetlenia Köhlera, używając kondensora w pozycji jasnego pola (0). Ten krytyczny krok ma na celu zapewnienie właściwego ustawienia obiektywu mikroskopu, kondensora i diafragmy polowej. Po prawidłowym ustawieniu mikroskopu, otwórz diafragmę apertury kondensora i ustaw wieżyczkę kondensora w pozycji 10 (zwykle powoduje to automatyczne otwarcie diafragmy apertury). Umieścić zielony filtr na drodze światła i wyjąć jeden z okularów. Włożyć teleskop fazowy i obserwując tylną stronę obiektywu, użyć śrub centrujących pierścień, aby wycentrować pierścień względem pierścienia płytki. Soczewka Bertranda lub okular otworkowy, jeśli jest dostępny, pozwoli na obserwację tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu. Wycentrowanie pierścienia fazowego jest często łatwiejsze do wykonania, gdy próbka jest chwilowo usunięta z drogi światła. Po wyrównaniu pierścienia fazowego z pierścieniem, należy ponownie włożyć okular i umieścić preparat na właściwym miejscu na statywie mikroskopu w torze optycznym.

Powtórzyć tę samą procedurę dla każdego obiektywu, upewniając się, że wieżyczka jest obrócona tak, że odpowiedni pierścień fazowy jest ustawiony zgodnie z powiększeniem obiektywu. Niektórzy producenci dostarczają indywidualne pierścienie centrujące, które można włożyć do dolnej części zwykłego kondensora Abbego. Takie niedrogie, proste urządzenia dobrze radzą sobie z obiektywami fazowymi 10X, 20X i 40X, ale kondensor może przyjąć tylko jeden na raz.

Mikroskopia fazowa jest nadal szeroko stosowanym i ważnym narzędziem, szczególnie dla mikroskopisty badającego żywy i/lub nie wybarwiony materiał, taki jak komórki i tkanki w hodowli. Metoda ta jest również obecnie stosowana jednocześnie z fluorescencją w świetle odbitym, aby ujawnić obszary próbki, które nie fluoryzują. Techniki mikroskopii fazowej są szczególnie przydatne w przypadku próbek, które są cienkie i rozproszone w polu widzenia.

Istnieją pewne ograniczenia mikroskopii kontrastu fazowego:

• Obrazy fazowe są zwykle otoczone przez aureole wokół konturów szczegółów. Takie aureole są artefaktami optycznymi, które czasami przesłaniają granice szczegółów.
• Roczniki fazowe ograniczają roboczą aperturę numeryczną układu optycznego do pewnego stopnia, zmniejszając tym samym rozdzielczość.
• Kontrast fazowy nie działa dobrze w przypadku grubych próbek, ponieważ przesunięcia fazowe występują w obszarach nieco poniżej lub nieco powyżej płaszczyzny, która jest w centrum uwagi. Takie przesunięcia fazowe mylą obraz i zniekształcają szczegóły obrazu.
• Obrazy fazowe pojawiają się szare, jeśli używane jest białe światło i zielone, jeśli używany jest zielony filtr. W przeszłości wielu mikroskopistów ograniczało swój film do czerni i bieli podczas wykonywania fotomikrografii na próbkach fazowych. Obecnie wiele filmów kolorowych odtwarza czerń, biel i odcienie szarości bardzo skutecznie, zwłaszcza zrównoważone wolframem filmy przezroczyste z Fuji, Kodak i Agfa.

Mikroskopia fazowa jest kolejną egzemplifikacją tego, jak manipulacja światłem na poziomie dolnego kondensora podprogowego i na poziomie tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu ma znaczący wpływ na obraz obserwowany przez okular.

Michael W. Davidson – National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.